李青卓，王嘉瑞，張小龍，付彩霞，汪 超，徐 寧，呂文平*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 443000；2.湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

近年來(lái)，隨著天然產(chǎn)品的流行，使得人們對(duì)香氣成分的興趣日益增加，4-乙烯基衍生物被監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)為調(diào)味劑[2]和肉類產(chǎn)品的保存劑。除了具有作為香料和添加劑的商業(yè)價(jià)值外，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚由于其抗氧化活性和抗癌活性[3]，在醫(yī)藥制品領(lǐng)域，如用于眼科領(lǐng)域，作為隱形眼鏡溶液和滴眼劑[4]也存在潛在的藥用價(jià)值。近年來(lái)，全球市場(chǎng)對(duì)天然芳香化合物的需求逐步增長(zhǎng)，所以，尋找安全高效的天然4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生物合成途徑是很有必要的。

1 4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)

4-乙烯基愈創(chuàng)木酚為乙烯基酚衍生物，一種吡喃花青素，是包括香草醛在內(nèi)的一組芳香族單體酚成員，在食品工業(yè)中被廣泛用作調(diào)味劑。其分子式為C9H10O2，密度1.11×103kg/m3，熔點(diǎn)26～29 ℃，沸點(diǎn)100 ℃/667 Pa。天然4-乙烯基愈創(chuàng)木酚主要存在于玉米酒精發(fā)酵的揮發(fā)物中，為無(wú)色或淡黃色油狀液體，有發(fā)酵氣息、微帶甜味和獨(dú)特的酚感，不溶于水，但溶于甲醇和油類。4-乙基烯愈創(chuàng)木酚的分子結(jié)構(gòu)如下：

4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的分析檢測(cè)方法數(shù)量有限，該領(lǐng)域早期工作主要采用氣相色譜法，但是此方法較為復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)。近年來(lái)，人們對(duì)高效液相色譜法使用較為普遍，MADIGAN D等[5]確定了一種高效液相色譜法測(cè)定麥汁、啤酒中的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量，該方法簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確，精密度高，其次還有頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用、熒光檢測(cè)等方法[6]。

2 4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生物合成

目前，市場(chǎng)上的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚多采用化學(xué)法合成，需要較多的前體物質(zhì)。有些還需要較為劇烈的條件，如高溫高壓，微波加熱誘導(dǎo)脫羧等[7]。但化學(xué)合成法生產(chǎn)出的產(chǎn)品都不屬于天然物質(zhì)。由于4-乙烯基愈創(chuàng)木酚很大一部分用于香精、醫(yī)藥及食品工業(yè)，而化學(xué)合成品用于這些行業(yè)有很大的不安全性。所以，尋找快速安全生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生物合成途徑是很有必要的?，F(xiàn)有研究報(bào)道4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生物合成法有微生物發(fā)酵法、植物細(xì)胞培養(yǎng)法和酶法。

2.1 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是指微生物在適宜的條件下，對(duì)底物進(jìn)行分解和利用從而轉(zhuǎn)化為人類所需產(chǎn)物的過(guò)程，它的優(yōu)點(diǎn)是避免使用重金屬，有機(jī)溶劑以及強(qiáng)酸和強(qiáng)堿，因此合成過(guò)程對(duì)環(huán)境友好，并且因其生產(chǎn)成本較低，所以微生物發(fā)酵法成為近年來(lái)生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的研究趨勢(shì)。已有研究表明，多種細(xì)菌和真菌能夠?qū)⑽核崦擊绒D(zhuǎn)化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚[8]。

MISHRA S等[9]綜述了微生物催化阿魏酸轉(zhuǎn)化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的7種不同代謝途徑。具體途徑如下：

以上代謝途徑表明了阿魏酸生物轉(zhuǎn)化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的過(guò)程中微生物以及其他高附加值化合物呈現(xiàn)多樣性。在途徑1中[10]，阿魏酸經(jīng)醌型中間體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成另一種醌型中間體從而形成1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-乙醇和香草酮。另外，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚也可以轉(zhuǎn)化為4-乙基愈創(chuàng)木酚、香草醛、香草酸和原兒茶酸。

在途徑2中提出了阿魏酸可以利用腸桿菌（Enterobacter soli）形成4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，此外也產(chǎn)生了少量的香草醛、香蘭醇和香草酸[11]。在途徑3中，鏈霉菌（Streptomyces setonii）ATCC 39116在測(cè)試培養(yǎng)基中對(duì)阿魏酸進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生了4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（物質(zhì)的量產(chǎn)率為111%）、香草醛、香草酸、香草醇和原兒茶酸[12]。在途徑4中，凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）BK07可在7 h內(nèi)將阿魏酸催化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，與途徑3相比，此途徑的不同之處在于香草醛未氧化為香草醇[13]。在途徑5中，黑曲霉（Aspergillus niger）DAR2的二倍體菌株與途徑4中凝結(jié)芽孢桿菌BK07降解阿魏酸的途徑相同，但是將其再培養(yǎng)120 h后香草醛會(huì)被氧化成香草酮和香草醇[14]。在途徑6中，費(fèi)氏乳桿菌（Lactobacillus farciminis）將阿魏酸轉(zhuǎn)化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚作為唯一的代謝產(chǎn)物，摩爾產(chǎn)率為26.50%。然而，在途徑7中，白腐真菌在24 h內(nèi)將阿魏酸降解為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚作為主要的代謝產(chǎn)物，將其進(jìn)一步培養(yǎng)24 h則會(huì)導(dǎo)致少量香草醛、香草酮和香草酸的產(chǎn)生[15]。

例如，在學(xué)習(xí)關(guān)于重量的內(nèi)容時(shí)，我就帶了兩袋食鹽和一袋洗衣粉，另外還有硬幣，其中食鹽的袋子上標(biāo)注著500克，洗衣粉的袋子上標(biāo)注著1000克，而硬幣上面沒(méi)有標(biāo)注。通過(guò)觀察實(shí)物，學(xué)生就能夠?qū)χ亓坑幸粋€(gè)大概的認(rèn)識(shí)，并且對(duì)重量單位也有了基本的了解。又如，在教學(xué)“周長(zhǎng)”相關(guān)內(nèi)容時(shí)，我讓學(xué)生量一量黑板、課桌、書(shū)本的長(zhǎng)和寬，然后計(jì)算，甚至可以在父母的幫助下量一量自己家里家具面的長(zhǎng)和寬。

2.2 植物細(xì)胞培養(yǎng)法

許多天然香料成分主要來(lái)源于植物，植物細(xì)胞培養(yǎng)是一種使植物細(xì)胞在培養(yǎng)液中合成代謝產(chǎn)物從而獲取天然香氣化合物的技術(shù)。植物是許多天然香料成分的主要來(lái)源，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是隨著生物技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展起來(lái)的一種使植物細(xì)胞在培養(yǎng)液中合成代謝產(chǎn)物的技術(shù)。

植物細(xì)胞培養(yǎng)法可以通過(guò)阿魏酸的生物催化脫羧反應(yīng)而合成多種天然芳香化合物，如4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、3-硝基苯乙烯和呋喃。TAKEMOTO M等[16]利用懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞制備4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，這些細(xì)胞是從煙草、胡蘿卜、野茶樹(shù)和長(zhǎng)春花中分離出來(lái)的，當(dāng)?shù)孜锓词桨⑽核峒尤爰?xì)胞懸浮液中進(jìn)行植物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可以定量產(chǎn)出4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，其中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在長(zhǎng)春花發(fā)酵液中的轉(zhuǎn)化率為65%，煙草為50%，胡蘿卜為30%；在以野茶樹(shù)為原料的發(fā)酵液中底物反式阿魏酸無(wú)法生物脫羧為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有培養(yǎng)條件不易控制、細(xì)胞位置不固定、難以形成愈傷組織和極易發(fā)生污染等缺點(diǎn)[17]，所以目標(biāo)產(chǎn)物4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的產(chǎn)量不高，這可通過(guò)細(xì)胞固定化培養(yǎng)加以改善，提高4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量。

2.3 酶法

所有的生物代謝反應(yīng)都是酶促反應(yīng)。盡管上述幾種方法的作用機(jī)理尚不完全清晰，但可以確定它們都是由一種或幾種酶引起的。如能分離得到這些酶，利用酶促反應(yīng)，則可更直接高效地生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。目前國(guó)內(nèi)外的研究狀況如表1所示。

酶促反應(yīng)制備天然香氣化合物最重要的優(yōu)點(diǎn)是，副產(chǎn)物較少，底物的可選擇性高，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單溫和，從而可以一步生成對(duì)應(yīng)體化合物。但在一定程度上，利用酶法生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚容易受到底物濃度、酶活性和穩(wěn)定性的影響，所以如何優(yōu)化底物濃度以及利用生物手段和酶學(xué)知識(shí)對(duì)酚酸脫羧酶進(jìn)行純化、定向改造，研究其改造固定化技術(shù)從而增加酶的穩(wěn)定性，是人們運(yùn)用酶法生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚將要面臨的主要工作。

表1 酶法生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的國(guó)內(nèi)外研究情況Table 1 Research progress of enzymatic production of 4-vinylguaiacol at home and abroad

3 發(fā)酵食品中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的作用

3.1 白酒

白酒的香味化合物十分復(fù)雜，種類繁多，其中揮發(fā)性酚類化合物是白酒中的重要香味組成部分，對(duì)于白酒的香氣、口感及穩(wěn)定性等方面均有著重要的作用[23]。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在白酒中的含量極少，但呈香作用卻很強(qiáng)，僅幾千分之一就能使人感覺(jué)到其特有的香氣。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是白酒中常見(jiàn)的呈香和呈味化合物，且風(fēng)味活性較高。其香味閾值為209.30 μg/L[24]，對(duì)白酒整體貢獻(xiàn)水果香、花香和甜香。

崔利[25]在研究形成醬香型白酒風(fēng)格屬性的關(guān)鍵工藝時(shí)，發(fā)現(xiàn)在高溫制曲的過(guò)程中，阿魏酸與植物細(xì)胞壁相連接的酯鍵斷裂從而釋放阿魏酸，在曲霉、酵母等微生物的作用下生成4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、香草醛和香草酸等酚類化合物，其中4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚賦予醬香型白酒特有的甜香、花香和煙熏風(fēng)味。柳軍[26]研究表明，在口子窖酒中，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚具有最大的香氣強(qiáng)度值（Intensity＞3.50），呈中藥氣味，其次是4-乙基愈創(chuàng)木酚和香草醛（Intensity＞3.00）。由香氣強(qiáng)度值可知，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和香蘭素對(duì)口子窖酒整體香氣貢獻(xiàn)較大，主要賦予口子窖酒藥香與甜香，使其醇香宜人。楊玉波等[27]對(duì)茅臺(tái)酒的香氣成分進(jìn)行了分析，并結(jié)合風(fēng)味成分氣味活性值（odor activity values，OAV）值分析發(fā)現(xiàn)苯乙醛、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和愈創(chuàng)木酚3 種化合物的OAV值均＞1，從而明確4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是焦糖香的關(guān)鍵化合物，苯乙醛主要貢獻(xiàn)了甜香和花香特征。

3.2 啤酒

在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中，小麥麥殼中的阿魏酸進(jìn)行酶促或熱分解產(chǎn)生4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，雖然啤酒中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚感官閾值很低僅為0.3 mg/L，但它的存在可以賦予啤酒辛辣、煙熏和丁香般的風(fēng)味[28]。在大多數(shù)下面發(fā)酵啤酒中，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的風(fēng)味被認(rèn)為是不可取的，因而被稱為是酚類異味，所以這些啤酒中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的存在可作為啤酒廠中野生酵母或細(xì)菌污染的指標(biāo)。盡管它在下面發(fā)酵啤酒中是異味物質(zhì)，但4-乙烯基愈創(chuàng)木酚卻是形成比利時(shí)啤酒、德國(guó)維岑啤酒和勞赫啤酒等上面發(fā)酵啤酒香氣的必需成分。

COGHE S等[29]研究上面發(fā)酵啤酒時(shí)指出，酚類化合物是構(gòu)成上面發(fā)酵小麥啤酒特有風(fēng)味屬性的重要物質(zhì)，而其中的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-vinylguaiacol，4VG）和4-乙烯基苯酚（4-vinylphenol，4VP）起著關(guān)鍵作用，它們分別具有木質(zhì)香和刺激的酸味。上述兩種風(fēng)味物質(zhì)存在于釀造麥芽中，經(jīng)過(guò)制麥和糖化等工序進(jìn)入啤酒中。其中4VG 是影響成品酒香氣形成的關(guān)鍵組分，4VP 是成品酒風(fēng)味中不可缺少的組分。根據(jù)成東東[30]的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，比利時(shí)和德國(guó)小麥啤酒中都含有相對(duì)較高的4VG和4VP，其中，比利時(shí)小麥啤酒中4VG、4VP含量分別為3.251 mg/L和1.268 mg/L，德國(guó)小麥啤酒中4VG、4VP含量分別為3.690 mg/L和1.572 mg/L，這與在成品小麥啤酒的感官品評(píng)中德國(guó)小麥啤酒的酚香味稍濃于比利時(shí)小麥啤酒的結(jié)果是吻合的。

3.3 葡萄酒

隨著葡萄酒化學(xué)學(xué)科的形成和發(fā)展，葡萄酒品質(zhì)的分析集中在其香氣和風(fēng)味物質(zhì)上，葡萄酒的香氣質(zhì)量是影響葡萄酒品質(zhì)和消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)意向的主要因素。在葡萄酒的感官方面，羥基肉桂酸對(duì)葡萄酒的風(fēng)味影響不大，但其衍生物如4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚對(duì)葡萄酒的風(fēng)味產(chǎn)生有很大的影響[31]。這些揮發(fā)性酚的感官閾值較低，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味形成具有促進(jìn)作用。但是超過(guò)一定濃度（極限閾值=725 μg/L乙烯基苯酚混合物，即4-乙烯基愈創(chuàng)木酚∶4-乙烯基苯酚=1∶1），可使葡萄酒帶有動(dòng)物皮革、馬廄或馬汗的味道，嚴(yán)重影響酒的風(fēng)味[32]。RAPP A[33]研究認(rèn)為，當(dāng)乙烯基苯酚混合物的閾值＞800 μg/L時(shí)，葡萄酒會(huì)出現(xiàn)塑料和繃帶等異嗅。

研究發(fā)現(xiàn)，羥基肉桂酸通過(guò)羥基苯乙烯脫羧酶轉(zhuǎn)化為其乙烯衍生物，然后經(jīng)還原酶還原為乙基衍生物[34]，前人研究報(bào)道釀酒酵母可以通過(guò)非氧化脫羧作用將葡萄酒中的對(duì)香豆酸和阿魏酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的乙烯基酚，其中葡萄酒內(nèi)4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈木創(chuàng)酚的含量為0～2.8 g/L[35]。因此，對(duì)于釀酒師來(lái)說(shuō)，控制葡萄酒中這些揮發(fā)性酚類化合物的濃度非常重要。

3.4 醬油

醬油是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品，香氣是醬油風(fēng)味的重要品質(zhì)特征，許多研究表明酚類物質(zhì)是醬油醬香味的主要來(lái)源，雖然它們的含量不高，但具有相對(duì)較高的氣味活度值，因此對(duì)醬油的風(fēng)味特性（如濃郁的醬香香氣）具有決定性作用[36]。醬油原料中的木質(zhì)素經(jīng)米曲霉作用斷裂酯鍵釋放出阿魏酸，然后在酵母菌的作用下形成酚類物質(zhì)，其中在醬油中具有代表性的酚類成分是4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚，它們的香氣特征十分強(qiáng)烈且活性明顯，賦予醬油丁香香味和煙熏的香氣，于整體風(fēng)味感管至關(guān)重要。醬油中含有微量的4VG和4-EG就可以明顯提高醬油的風(fēng)味[37]。

劉巍等[38]利用同時(shí)蒸餾萃取和固相微萃取技術(shù)分析醬油中揮發(fā)性組分時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)醬油香氣成分貢獻(xiàn)最大的是4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-羥基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）呋喃酮（4-hydroxy-2（5）-ethyl-5（2）-methyl-3（2H）furanone，HEMF）、乙醇、2,3-丁二醇以及3-甲硫基丙醇。并且指出4-乙烯基愈創(chuàng)木酚具有特征的醬香和煙熏香，且香氣活性強(qiáng)，對(duì)醬油風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，而使得風(fēng)味更加豐滿，是提高香氣特征的關(guān)鍵，同時(shí)它也具有中和調(diào)節(jié)醬油中鹽分的呈味作用。李楊等[39]對(duì)醬油的香氣成分進(jìn)行了分析，并結(jié)合OAV值確定了醬油中主要的香氣物質(zhì)為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、1-辛烯-3-醇、苯乙醛和乙酸。其中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在所有醬油樣品中均檢出，并且含量相對(duì)較高，平均香氣活性值達(dá)到3.4，能為醬油貢獻(xiàn)煙熏香氣。

4 展望

隨著4-乙烯基愈創(chuàng)木酚應(yīng)用范圍的逐步擴(kuò)大，其市場(chǎng)價(jià)值、產(chǎn)品性質(zhì)和合成方法越來(lái)越受到人們的關(guān)注。利用生物合成法制備4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是一項(xiàng)新興的技術(shù)，以其成本低、污染小、天然性和安全性高等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于食品行業(yè)，雖然生物合成法生產(chǎn)天然4-乙烯基愈創(chuàng)木酚正處在初步的探索階段，但是無(wú)疑具有廣闊的發(fā)展前景。

目前4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生物合成法研究已經(jīng)取得一些實(shí)質(zhì)性進(jìn)步，但要真正實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，逐步提高4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等風(fēng)味物質(zhì)的含量，以全面提升白酒、啤酒、葡萄酒和醬油等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的質(zhì)量，還需進(jìn)一步解決如下問(wèn)題：闡明4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的形成途徑及代謝機(jī)理，篩選出產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚較高的微生物，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、酶分離提純技術(shù)以及生物合成方法的建立與完善。