牟良群，林美芳，孫 濱，王云英

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，重慶 400010)

慢性乳腺炎發(fā)病機制尚未完全明確，與細菌學的關(guān)系長期以來備受爭議，但近年來不斷出現(xiàn)慢性乳腺炎合并感染克氏棒桿菌的病例報道。據(jù)文獻報道，克氏棒桿菌菌株幾乎全部從慢性乳腺炎患者膿液中分離獲得[1-2]。克氏棒桿菌為親脂性棒桿菌，需在高脂環(huán)境中生存[3]；親脂性是此菌的主要致病特征，經(jīng)產(chǎn)婦女的乳腺組織進一步發(fā)育很可能是細菌易感的原因，富含脂肪的乳腺組織為其生長提供了最佳生存環(huán)境。在本院就診的慢性乳腺炎患者中越來越多的患者合并感染克氏棒桿菌。本研究收集本院從慢性乳腺炎患者中分離的克氏棒桿菌19株，對其耐藥性進行了分析，并探討了其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1菌株來源 收集2018年9月至2020年3月本院從臨床住院慢性乳腺炎患者中分離的克氏棒桿菌 19株，同一患者多次分離該菌株僅收集第1次菌株納入研究。其中漿細胞性乳腺炎(PCM)患者12例(63.2%，PCM組)，肉芽腫性乳腺炎(GM)患者7例(36.8%，GM 組)。

1.1.2儀器與試劑 3D血培養(yǎng)瓶、E-實驗抗菌藥物(法國梅里埃公司)、哥倫比亞血平板、血MH平板(賽默飛)、吐溫-80等；BacT/Alert 3D 血培養(yǎng)儀(法國梅里埃公司)、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀(BD布魯克)、聚合酶鏈反應(yīng)儀、凝膠成像儀(美國 Bio-Rad 公司)等。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集 采用回顧性分析對PCM和GM中分離出的19株克氏棒桿菌感染患者進行臨床資料的收集及分析，臨床診斷以病理檢查結(jié)果為準。臨床資料包括患者年齡、性別、臨床診斷、抗生素的使用、治療方式、生育情況、淋巴結(jié)腫大、月經(jīng)、乳頭溢液、乳頭內(nèi)陷、喝酒、吸煙、愈后和復發(fā)等。

1.2.2細菌培養(yǎng)、鑒定與藥敏試驗 采集患者術(shù)中膿液培養(yǎng)接種于哥倫比亞血平板，同時，將膿液注入血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜及測序方法進行細菌鑒定，16sRNA擴增引物序列：16sRNA-F：TGCCAGCAGCCGCGCGGTAATAC，16sRNA-R：CGCTCGTTGCGGGACTTAACC，測序結(jié)果在GenBank上進行比對(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)。藥敏試驗采用E-實驗方法，嚴格遵照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會推薦的瓊脂稀釋法，但細菌在含LHB的MH肉湯中生長不良，所以，采用E-實驗法，按M45-A3[4]進行結(jié)果判定，質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌 ATCC 49619和大腸埃希菌 ATCC 25922。

1.2.3克氏棒桿菌的改良培養(yǎng) 參照文獻[4]的方法，克氏棒桿菌在含1%的吐溫-80哥倫比亞血平板或含吐溫的腦浸液肉湯中生長良好，配制含1%的吐溫-80哥倫比亞血平板，觀察細菌生長情況。

2 結(jié) 果

2.12組患者一般資料比較 PCM組患者年齡26～41歲，GM 組患者年齡23～32歲。2組患者年齡、抗生素的使用等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組患者一般資料比較

2.2克氏棒桿菌的鑒定

2.2.1細菌的菌落和鏡下形態(tài) 細菌的菌落呈無色至灰色，無光澤，光滑，圓形，凸面，直徑小于1 mm，不溶血。顯微鏡觀察為細長革蘭陽性桿菌，形狀不規(guī)則，整體呈棒狀，端部膨大，無芽孢，抗酸染色陰性。見圖1。

A.克氏棒桿菌菌落形態(tài)；B.克氏棒桿菌顯微鏡下形態(tài)。圖1 細菌的菌落和鏡下形態(tài)

2.2.2質(zhì)譜和測序鑒定 克氏棒桿菌鑒定值大于1.9，參照文獻[1]準確鑒定為克氏棒桿菌；測序結(jié)果與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。

2.3藥敏試驗結(jié)果 19株克氏棒桿菌對萬古霉素、利奈唑胺、慶大霉素、利福平敏感率均達到100.0%，對青霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、美羅培南敏感率分別為20.0%、30.0%、10.0%、60.0%，而對紅霉素和克林霉素的耐藥率均為100.0%。見表2。

表2 克氏棒桿菌對10種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果

2.4生長情況 19株克氏棒桿菌在1%吐溫-80哥倫比亞血平板明顯比哥倫比亞血平板生長良好。

續(xù)表2 克氏棒桿菌對10種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果

3 討 論

慢性乳腺炎是指區(qū)別于急性乳腺炎的一種病因不明、病程遷延、好發(fā)于育齡經(jīng)產(chǎn)婦女非哺乳期的一種乳腺炎癥。臨床最常見的非特異性乳腺炎——PCM和GM通常認為與感染的關(guān)系不大[2，5]，但本研究結(jié)果顯示，較多PCM和GM患者膿液中分離得到克氏棒桿菌。有研究表明，此菌常常是在疾病發(fā)展早期被單獨分離出來[1-2]，患者受感染后誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，促使乳腺小葉損傷加速[6-7]。PCM和GM伴克氏棒桿菌感染患者由于細菌擴散增長與時間成正比，單純手術(shù)治療完全清除難度相當大，且乳房切除術(shù)會影響乳房外形及其功能，大多數(shù)患者無法接受。因此，及時明確其病因，確定是否與感染有關(guān)，對患者的治療具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，克氏棒桿菌主要從PCM(12例)和GM(7例)患者膿腫期膿液中分離獲得，分離陽性率明顯高于其他國內(nèi)文獻報道[8]，與本研究所采取的培養(yǎng)方式相關(guān)，采用2種方法培養(yǎng)：(1)將膿液直接接種到哥倫比亞血平板；(2)將膿液接種到血培養(yǎng)瓶中，并將其放入全自動血培養(yǎng)箱中進行增菌培養(yǎng)。為進一步提高克氏棒桿菌檢出率，本研究改良了此菌的培養(yǎng)方式，參照文獻[4]的方法，配制含1%吐溫-80羊血瓊脂平板，結(jié)果顯示，此菌在吐溫瓊脂平板上生長良好。因此，作者建議對慢性乳腺炎患者的膿液培養(yǎng)需使用新組合培養(yǎng)方式以提高克氏棒桿菌檢出率，針對此類患者其膿液培養(yǎng)采取血培養(yǎng)瓶加吐溫瓊脂平板。本研究對細菌的鑒定主要采用BD布魯克質(zhì)譜(MALDI-TOF)和測序2種方法，結(jié)果顯示，二者一致性較好。

本研究結(jié)果表明，19株克氏棒桿菌對萬古霉素、利奈唑胺、慶大霉素、利福平敏感率均較高，達100.0%；對青霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、美羅培南敏感率分別為20.0%、30.0%、10.0%、60.0%；對紅霉素和克林霉素耐藥率均為100.0%，與文獻報道基本一致[8]。應(yīng)避免使用青霉素和頭孢菌素類抗生素，萬古霉素、利奈唑胺、慶大霉素和利福平雖敏感性較高，但由于克氏棒桿菌獨特的分子結(jié)構(gòu)，與分枝桿菌同屬革蘭陽性菌，形態(tài)結(jié)構(gòu)上與結(jié)核分枝桿菌具有一定相似性，分類學上親緣性較近；且在細胞內(nèi)以特殊的方式寄生致病，在嗜中性粒細胞浸潤的肉芽組織脂質(zhì)空泡中存活，而非炎癥組織中[9-10]。因此，只有高親脂性及高分布容積的藥物才能在這種環(huán)境下達到足夠的抑菌濃度[11]。在以上4種藥物中萬古霉素、慶大霉素屬水溶性抗生素，在體內(nèi)不能到達感染部位，而利福平具有較高親脂性，且到目前為止，仍是抗分枝桿菌的主要藥物，但單用某一種抗分枝桿菌藥物易產(chǎn)生耐藥性，中華預防醫(yī)學會婦女保健分會2016年發(fā)布的《非哺乳期乳腺炎診治專家共識》指出，對反復發(fā)作形成竇道、病理學檢查確診為導管周圍乳腺炎或乳腺導管擴張癥患者采用抗分枝桿菌治療已成共識，治療方案可選擇異煙肼、利福平、乙胺丁醇或吡嗪酰胺，臨床多使用三聯(lián)藥物。

對臨床表現(xiàn)為彌漫型伴棒狀桿菌感染的GLM患者，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用三聯(lián)抗分枝桿菌藥物能在一定程度上抑制棒狀桿菌的生長及繁殖，從而降低乳房局部炎性反應(yīng)，進而保證更好的乳房外形?？耸习魲U菌引起的感染特點表現(xiàn)為膿腫形成、肉芽腫性炎癥、進展成竇道或瘺管形成等。使治療過程中創(chuàng)傷性操作增加，乳房外形破壞率增加，甚至部分患者切除乳房才能避免反復復發(fā)，而保守治療常采取免疫抑制劑，所需時間較長，存在不能完全將乳腺炎癥病灶清除的問題，易導致疾病多次復發(fā)[12]。本研究PCM和GM患者中均有患者合并感染克氏棒桿菌，且2組患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。19例患者中采用膿腫切開引流加抗生素治療17例，療效良好；1例患者因反復復發(fā)行乳腺區(qū)段切除加利福平、異煙肼和乙胺丁醇三聯(lián)抗棒狀桿菌治療，1例患者未使用抗生素直接行乳腺區(qū)段切除。因此，明確慢性乳腺炎是否合并細菌感染，尤其是克氏棒桿菌感染，對此病的治療具有重要意義，對合并克氏棒桿菌感染患者如已形成膿腫者推薦采用膿腫切開引流加抗生素治療，特別是利福平、異煙肼和乙胺丁醇三聯(lián)抗棒狀桿菌治療，可抑制棒狀桿菌的生長及繁殖，降低乳房局部炎性反應(yīng)，避免切除乳房，保證更好的乳房外形，從而提高患者的生活質(zhì)量。

PCM、GM與克氏棒桿菌感染關(guān)系密切，因此，臨床醫(yī)師需及時送檢合格標本進行培養(yǎng)鑒定，明確是否合并細菌感染；檢驗工作者需提高對病原微生物的檢驗?zāi)芰?，及時、準確鑒定細菌。準確、快速地檢出此菌對患者的診治具有重要意義。