黃爭榮 林錦培 王 泳 賴義勤 張劭琴 何火聰

原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是臨床上常見的惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率居惡性腫瘤的第4位，腫瘤相關(guān)死亡第2位[1]。目前原發(fā)性肝癌的治療手段有手術(shù)、介入、靶向等，但由于肝癌起病隱匿，惡性程度高，病程短，臨床上較難早期發(fā)現(xiàn)，確診時往往病情已進入晚期，無法進行根治性治療，而中醫(yī)藥在肝癌綜合治療中具有日益重要的地位。既往研究[2，3]發(fā)現(xiàn)，通關(guān)藤對肝癌具有良好的抗腫瘤療效，能夠改善患者生活質(zhì)量。因此，本研究就該藥物的抗腫瘤作用作進一步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑MTE購于南京圣和藥業(yè)有限公司(商品名：消癌平注射液，國藥準(zhǔn)字Z20025868，生藥濃度為2.5 g/ml)；胎牛血、胰蛋白酶-EDTA、DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)；二甲亞砜(DMSO)(Gibco公司，美國)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(索萊寶科技有限公司，北京)；碘化丙錠、細(xì)胞周期試劑盒(Becton Dickinson公司，美國)。

1.2 主要儀器流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司,美國)；IX70倒置相差顯微鏡(Olympus公司，日本)；冷凍離心機(Thermo Electron 公司，美國)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司，江蘇)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2系由福建省腫瘤醫(yī)院生物放射研究室傳代培養(yǎng)。將HepG2肝癌細(xì)胞復(fù)蘇后，懸浮生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞進行實驗。

1.3.2 MTT法檢測MTE對HepG2細(xì)胞增殖的作用將HepG2細(xì)胞以密度為2×104個細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁，分別加入不同濃度的MTE (7.5 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml、60 mg/ml)，同時設(shè)空白對照組和調(diào)零組，每組3個復(fù)孔，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48h。實驗終止前4 h各加入MTT溶液10μl/孔，再置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100 μl DMSO，放置搖床低速振蕩10 min，待產(chǎn)生的藍(lán)紫色結(jié)晶溶解后，用酶標(biāo)儀檢測各孔OD值(490 nm)。計算抑制率：抑制率=(1-藥物處理組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.3 克隆形成實驗觀察MTE對HepG2肝癌細(xì)胞增殖的作用取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，用0.25%胰酶消化并用吸管吹打成單個細(xì)胞，分別接種于含完全培養(yǎng)液的6孔板中，200個細(xì)胞/孔。輕輕搖動，使細(xì)胞分散均勻，24 h細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)基，設(shè)置實驗組和空白對照組，實驗組各孔分別加濃度為15 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml MTE含藥培養(yǎng)基，每孔2 ml，對照組加等體積培養(yǎng)基。置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，吸取培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，用純甲醇固定細(xì)胞，加適量姬姆薩色素染細(xì)胞核10 min，然后用清水緩慢洗去染色液，干燥。將6孔板底部貼一張帶網(wǎng)格的透明膠片，倒置顯微鏡下計數(shù)克隆，含50個細(xì)胞以上形成的細(xì)胞集落為1個克隆，并計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MTE對HepG2肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響將細(xì)胞濃度為5×104/ml HepG2細(xì)胞接種于25 ml培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為15 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml MTE，設(shè)空白對照組。作用24 h后取出細(xì)胞，用將0.25%胰蛋白酶消化，收集1×106/ml細(xì)胞，用0.01 mol/L PBS pH 7.2清洗，離心(1500 rpm，5 min)，共2次。用300 μl PBS重懸，然后加入700 μl預(yù)冷的無水乙醇，固定30 min后，用PBS洗滌細(xì)胞2次。每管加入200 μl碘化丙錠(含100 μg/ml RNase)染色30 min，上流式細(xì)胞儀分析、檢測。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)方法實驗每組細(xì)胞平行重復(fù)3次。實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用單因素方差分析比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTE對HepG2肝癌細(xì)胞增殖的影響經(jīng)不同濃度藥物作用24 h，各劑量組MTE對HepG2肝癌細(xì)胞增殖均表現(xiàn)明顯抑制作用，抑制率隨藥物濃度的增加而增加，呈劑量與時間依賴效應(yīng)關(guān)系。5個不同濃度MTE組對HepG2肝癌細(xì)胞抑制作用均隨時間延長而增強，呈時間依賴效應(yīng)關(guān)系。見圖1。

圖1 MTE對HepG2肝癌細(xì)胞增殖的影響

2.2 MTE對HepG2肝癌細(xì)胞克隆形成的影響HepG2肝癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度MTE作用后，細(xì)胞克隆能力明顯下降，克隆形成數(shù)目顯著低于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而且形成的細(xì)胞克隆直徑也小于空白對照組。見圖2、表1。

注：A: 0 mg/ml組, B:15 mg/ml組, C:20 mg/ml組, D:30 mg/ml組

表1 MTE對HepG2肝癌細(xì)胞克隆形成的影響

2.3 MTE對HepG2肝癌細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著MTE作用濃度的增加，G1期細(xì)胞所占的比例逐漸上升，S期細(xì)胞所占的比例逐漸下降，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 MTE對HepG2肝癌細(xì)胞周期的影響

表2 MTE對HepG2肝癌細(xì)胞周期的影響

3 討論

通關(guān)藤為蘿藦科牛奶菜屬植物，最早載于《滇南本草》，主要分布于云南、貴州、廣西等亞熱帶地區(qū)，味苦、微甘，性涼，具有清熱解毒、止咳平喘、祛痰等功效[4]。近年來，對通關(guān)藤的抗腫瘤作用研究已引起廣泛的關(guān)注，越來越多研究表明通關(guān)藤具有較強的抗腫瘤生物活性[5-7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MTE作用后HepG2肝癌細(xì)胞生長速度明顯減慢，各濃度的MTE對HepG2肝癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用，抑制率與對照組相比差異均有顯著性，且隨著MTE濃度增加和培養(yǎng)時間的延長，抑制作用增強，且呈明顯的量效關(guān)系和時效關(guān)系。另外，通過細(xì)胞克隆源性分析法驗證MTE對體外培養(yǎng)的HepG2肝癌細(xì)胞克隆形成的抑制效果，各實驗組細(xì)胞克隆形成率均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述兩種實驗表明MTE對HepG2肝癌細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。

細(xì)胞增殖是細(xì)胞生命活動的基本特征之一。細(xì)胞通過細(xì)胞周期實現(xiàn)增殖，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因。細(xì)胞周期中某些重要的信號分子和周期蛋白家族發(fā)生突變或表達(dá)水平發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控改變，促使細(xì)胞增殖不受控制，分化能力減弱，喪失原有的細(xì)胞功能，最終發(fā)展成腫瘤細(xì)胞[8]。腫瘤細(xì)胞增殖的速度主要取決于細(xì)胞G0/G1期的長短，G0/G1期短，進入S期細(xì)胞增多，則腫瘤細(xì)胞增殖快，所以G1/S過渡是細(xì)胞周期進程的關(guān)鍵[9]。本實驗結(jié)果顯示，不同濃度的MTE作用于HepG2肝癌細(xì)胞24 h后，肝癌細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化，G0/G1期細(xì)胞百分比上升，S期和G2期細(xì)胞百分比下降，提示MTE能夠誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞G1/S期阻滯，表現(xiàn)為細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，不能進入S期而使細(xì)胞生長周期延長，細(xì)胞的惡性增殖減慢。由此提示，MTE對HepG2肝癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，其機制可能是阻斷細(xì)胞周期，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，但如何影響細(xì)胞周期G1/S檢查點調(diào)控信號機制仍需進一步研究。