趙曉寧，羅月，張國城，吳丹，霍勝偉，沈上圯

（北京市計量檢測科學(xué)研究院，北京 100012）

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，醫(yī)藥、生物、材料、環(huán)境等學(xué)科逐漸由宏觀向微觀延伸，研究尺度向微米甚至納米級別拓展。顆粒物標(biāo)準物質(zhì)作為測量技術(shù)中質(zhì)量控制和量值傳遞的關(guān)鍵材料，在科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛［1］。目前計量領(lǐng)域使用的亞微米粒子有用于塵埃粒子計數(shù)器的粒徑分別為0.3、0.5、0.7、1.0 μm 的聚苯乙烯粒子，和用于環(huán)境檢測GB／T 18204.2–2014 《公共場所衛(wèi)生檢驗方法第2 部分：化學(xué)污染物》的粒徑為0.6 μm 的聚苯乙烯粒子［2］，以及粒徑譜儀和塵埃粒子計數(shù)器校準用的粒徑為0.3～1.2 μm 的聚苯乙烯粒子。

對于納米級聚苯乙烯小球標(biāo)準物質(zhì)，目前美國國家標(biāo)準與技術(shù)研究院開發(fā)了粒徑為0.3 μm的SRM 1690 標(biāo)準物質(zhì)；美國賽默飛世爾科技公司開發(fā)的Duke 標(biāo)準粒子是粒徑為0.05～1.0 μm 的13 種標(biāo)準物質(zhì)；國防科技工業(yè)顆粒度一級計量站與北京海岸鴻蒙標(biāo)準物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司開發(fā)的5 種塵埃粒子計時器校準用標(biāo)準物質(zhì)，粒徑分別為0.321、0.426、0.513、0.603、0.939 μm；中國石油大學(xué)重質(zhì)油國家重點實驗室與中國石油大學(xué)開發(fā)的8 種聚苯乙烯微球粒度標(biāo)準物質(zhì)，粒徑分別為0.079 1、0.117、0.299、0.333、0.582、0.763、0.855、1.089 μm；中國計量科學(xué)研究院開發(fā)的10 種微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)，粒徑分別為0.065 2、0.084、0.115 1、0.209 1、0.280 3、0.424 5、0.487 2、0.709 3、0.776 2、1.294 μm。

聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)的合成方法主要有乳液聚合法、分散聚合法、無皂乳液聚合法、微乳液聚合法、種子聚合法和溶脹聚合法等［3］。聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)的定值方法主要有電子顯微鏡法（透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡）、光學(xué)顯微鏡法、動態(tài)光散射法、電遷移法等［4］。

流行病學(xué)研究表明，大氣顆粒物濃度的短期增加與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率有密切的關(guān)系［5–6］，而顆粒物的粒徑是影響人體健康的一項重要參數(shù)，細粒子尤其是亞微米細粒子(空氣動力學(xué)直徑不大于1 μm 的顆粒物，PM1)比粗粒子呈現(xiàn)出更高的健康風(fēng)險［7］。呼吸道疾病絕大多數(shù)是在有限空間內(nèi)（相對密閉的室內(nèi)環(huán)境或公共交通工具）感染并傳播的，與室外環(huán)境相比，病原性微生物氣溶膠在有限空間內(nèi)的傳播擴散機制對預(yù)防和控制呼吸道傳染病更為重要。病原性微生物氣溶膠（微生物本身或病源微生物附著在環(huán)境顆粒物上形成的）的物理特性，如粒子大小、數(shù)量、初始速度對于傳播擴散具有重要影響，其中粒徑對于疾病傳播起決定性作用。環(huán)境微生物氣溶膠粒子（細菌、真菌、孢子、花粉等）粒徑為0.5～100 μm，病毒尺寸為20～300 nm［8–10］。微生物氣溶膠的研究模式有實驗室研究方法—直接使用微生物形成氣溶膠，以及數(shù)值模擬方法—用流體力學(xué)計算微生物氣溶膠在空氣中運動軌跡或空間分布。實驗室研究方法中微生物培養(yǎng)檢測耗時長，且存在微生物感染的風(fēng)險；數(shù)值模擬方法不能完全模擬微生物氣溶膠在實際傳播過程中的各種環(huán)境因素［11］。

利用標(biāo)準粒子可以在環(huán)境模擬艙內(nèi)模擬微生物氣溶膠傳播中的相關(guān)物理因素（微粒大小、在空間內(nèi)濃度和空間分布），既可以獲得病源微生物氣溶膠傳播性質(zhì)，也可以避免較高的微生物感染風(fēng)險，具有重要的現(xiàn)實意義。國內(nèi)外雖然已經(jīng)有不少可用于常規(guī)儀器計量檢測的亞微米級的粒度標(biāo)準物質(zhì)，但要用于模擬30 m3微生物氣溶膠空間或者更大的環(huán)境空間，目前亞微米級粒度標(biāo)準物質(zhì)的產(chǎn)量和價格均無法滿足實際應(yīng)用需求。

為滿足國家市場監(jiān)管總局及國家自然基金項目中大量使用亞微米標(biāo)準物質(zhì)需求，筆者采用無皂乳液聚合法及分散聚合一步合成法制備了粒徑分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μm 的8 種規(guī)格的聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)，經(jīng)場發(fā)射掃描電子顯微鏡及圖像分析軟件對顆粒的直徑進行測量，對標(biāo)準物質(zhì)的均勻性與穩(wěn)定性進行檢驗，并對定值結(jié)果的不確定度進行評定。研制的聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)具有良好的均勻性與穩(wěn)定性，有效期為12個月。該系列標(biāo)準物質(zhì)符合國家二級標(biāo)準物質(zhì)要求，為后期開展模擬病源性微生物氣溶膠傳播的相關(guān)因素研究打下了良好的基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

場發(fā)射掃描式電子顯微鏡：蔡司Sigma300 型，德國卡爾·蔡司股份公司。

一維柵格標(biāo)準樣板：1 000 nm，中國計量科學(xué)研究院。

無水乙醇、氫氧化鈉、過硫酸鉀：均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

苯乙烯、二乙烯基苯、聚乙烯吡咯烷酮、偶氮二異丁腈：均為分析純，上海滬試實驗室器材股份有限公司。

微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)：標(biāo)準值為1 280 nm，編號為GBW 12031，批號為202002，中國計量科學(xué)研究院。

1.2 儀器工作條件

放大倍率：300 00 倍；加速電壓：5 kV；測微尺標(biāo)準長度l：250.2 nm；測微尺測量長度L：253.3 nm；像素點寬度：3.9 nm。

1.3 標(biāo)準物質(zhì)制備

無皂乳液聚合：將一定量的水加入至500 mL三口燒瓶中，恒溫水浴加熱至70～75 ℃，然后加入一定量的過硫酸鉀，并將一定量的苯乙烯單體滴加至反應(yīng)體系中，控制攪拌速度，在氮氣保護下反應(yīng)24 h，得到單分散的聚苯乙烯微球乳液，通過控制苯乙烯單體含量得到粒徑分別為0.3、0.4、0.5、0.6 μm的4 種聚苯乙烯微粒。

分散聚合：將一定量的聚乙烯醇和無水乙醇加入至500 mL 三口燒瓶中，待聚乙烯醇完全溶解后，將三口燒瓶置于恒溫水浴中加熱至70～75 ℃，根據(jù)所需要制備粒子大小，將一定量的苯乙烯單體、交聯(lián)劑二乙烯基苯及引發(fā)劑偶氮二異丁腈加入至三口燒瓶中，控制攪拌速度，冷凝回流，在氮氣保護下反應(yīng)10 h，得到單分散的聚苯乙烯微球乳液。通過控制單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑含量得到粒徑分別為0.7、0.8、0.9、1.0 μm 的4 種聚苯乙烯微粒。

1.4 球形度檢驗

已合成的聚苯乙烯微球需進行球形度檢驗［12］，結(jié)果表明，8 種粒子的球形度分別為0.986、0.988、0.987、0.986、0.980、0.977、0.981、0.976，均大于0.95，符合要求［13］。篩選合格后的聚苯乙烯微球形態(tài)如圖1 所示。

圖1 篩選合格后的聚苯乙烯微球形態(tài)

1.5 均勻性檢驗

依據(jù)JJF 1343–2012 《標(biāo)準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》［14］對聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)進行均勻性檢驗。根據(jù)標(biāo)簽編號從已分裝的200瓶標(biāo)準物質(zhì)中隨機抽取12 瓶，從每瓶的上、中、下部隨機抽取樣品進行測定。采用單因素方差分析法，利用F 檢驗判斷標(biāo)準物質(zhì)的均勻性。

1.6 穩(wěn)定性檢驗

1.6.1 短期穩(wěn)定性檢驗

短期穩(wěn)定性考察了低溫環(huán)境（5 ℃）及高溫環(huán)境（60 ℃）下的穩(wěn)定性。

將樣品置于5 ℃恒溫箱中保存，分別在第0、1、3、7、14 天取出進行測定。測量前，先將標(biāo)準物質(zhì)樣品在室溫條件下放置1 h，每瓶樣品經(jīng)充分混勻后隨機抽取1 000 粒測定粒徑，取1 000 粒的平均粒徑作為一次測定的數(shù)量平均粒徑。

將樣品置于60 ℃恒溫箱中保存，分別在第0、1、3、7、14 天取出進行測定。測量前，先將標(biāo)準物質(zhì)樣品在室溫條件下放置1 h，每瓶樣品經(jīng)充分混勻后隨機抽取1 000 粒測定，取1 000 粒的平均粒徑作為一次測定的數(shù)量平均粒徑。

采用直線擬合法分別對低溫和高溫穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并對短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果進行評估。

1.6.2 長期穩(wěn)定性檢驗

將樣品置于室溫環(huán)境中保存，分別在第0、1、3、7、12 個月取出進行測定。測量前，先將標(biāo)準物質(zhì)樣品在室溫條件下放置1 h，每瓶樣品經(jīng)充分混勻后隨機抽取1 000 粒測定粒徑，取1 000 粒的平均粒徑作為一次測定的數(shù)量平均粒徑。采用直線擬合法對檢驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并對長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果進行評估。

1.7 標(biāo)準物質(zhì)定值

樣品由一排等大小的微球組成，顆粒的投影面積按式(1)計算：

式中：A——顯微圖像中顆粒的投影面積；

N——顯微圖像中單顆粒所占的像素；

δ2——顯微圖像中單顆粒所占的面積。

顯微圖像中單個顆粒半徑、單個顆粒直徑分別按式(2)和式(3)計算：

式中：Ri——單個顆粒半徑，μm；

Di——單個顆粒直徑，μm；

l——測微尺長度，μm；

L——測微尺在一定放大倍數(shù)下測定值，μm。

聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)的數(shù)量平均直徑按式(4)計算：

式中：Dmean——數(shù)量平均直徑，μm；

n——測量顆粒的個數(shù)。

顆粒直徑的標(biāo)準偏差s 和相對標(biāo)準偏差RSD分別按式(5)和式(6)計算：

掃描電子顯微鏡法是一種絕對測量方法［15–16］，參照國家標(biāo)準GB／T 21649.1–2008 《粒度分析圖像分析法 第1 部分：靜態(tài)圖像分析法》，在1.2 儀器工作條件下進行測定。經(jīng)過圖像分析后，計算顆粒的數(shù)量平均粒徑、標(biāo)準偏差、相對標(biāo)準偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 均勻性檢驗

按照1.5 方法對制備的聚苯乙烯微粒進行均勻性檢驗。以粒徑為1.0 μm 的聚苯乙烯微粒為例，測定結(jié)果列于表1。根據(jù)表1 數(shù)據(jù)，計算得組間差方和Q1=1.14×10–3，組內(nèi)差方和Q2=1.99×10–3，組間方差S12=Q1／υ1=1.04×10–4，組內(nèi)方差S22=Q2／υ2=8.30×10–5，統(tǒng)計量F=S12／S22=1.25，自由度υ1=11，υ2=24，查表得Fα=2.22，則F ＜Fα。同理計算其它7 種聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)樣品的F 值，統(tǒng)計結(jié)果見表2。由表2 可知，8 種粒徑的聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)的F 值均小于Fα，表明制備的聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)均勻性良好。

表1 粒徑為1.0 μm 聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)測定結(jié)果

表2 聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)均勻性檢驗統(tǒng)計結(jié)果

2.2 穩(wěn)定性檢驗

2.2.1 短期穩(wěn)定性檢驗

按照1.6.1 方法對制備的聚苯乙烯微粒進行短期穩(wěn)定性檢驗，8 種聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)數(shù)量平均粒徑測定結(jié)果見表3，統(tǒng)計結(jié)果見表4。

表3 8 種聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)數(shù)量平均粒徑測定結(jié)果 μm

表4 8 種聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)短期穩(wěn)定檢驗統(tǒng)計結(jié)果

由表4 可知，8 種粒徑的聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)均滿足|β1|＜t0.95，n–2s（β1），表明直線斜率不顯著，研制的8 種聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)分別在低溫（5 ℃）和高溫（60 ℃）環(huán)境下貯存14 天，其特征量值是穩(wěn)定的。

2.2.2 長期穩(wěn)定性檢驗

按照1.6.2 方法對制備的聚苯乙烯微粒進行長期穩(wěn)定性檢驗，8 種聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)數(shù)量平均粒徑測定結(jié)果見表5，統(tǒng)計結(jié)果見表6。

表5 標(biāo)準物質(zhì)數(shù)量平均粒徑測定結(jié)果 μm

表6 8 種聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)長期穩(wěn)定檢驗統(tǒng)計結(jié)果

由表6 可知，8 種粒徑的聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)均滿足|β1|＜t0.95，n–2s（β1），表明直線斜率不顯著，研制的8 種聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)在12個月內(nèi)特征量值是穩(wěn)定的。

2.3 不確定度評定

掃描電子顯微鏡測定顆粒物直徑的數(shù)學(xué)模型如式(7)所示。

式中：D——待測顆粒的直徑，μm；

l——測微尺的標(biāo)準長度，μm；

L——測微尺在該放大倍數(shù)下測定值，μm；

R——待測顆粒在該放大倍數(shù)下的測定值。

根據(jù)JJF 1343–2012 《標(biāo)準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》，標(biāo)準物質(zhì)的不確定度［17］由3 部分組成：定值引入的不確定度、均勻性檢驗引入的不確定度和穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度。其中定值引入的不確定度包括測微尺引入的不確定度、放大倍數(shù)校準引入的不確定度、測量待測顆粒引入的不確定度和取樣誤差引入的不確定度。

以上各不確定度分量互不相關(guān)，分別計算各不確定度分量并合成，得到標(biāo)準物質(zhì)定值的合成標(biāo)準不確定度，結(jié)果見表7。

表7 不確定度度分量及合成標(biāo)準不確定度 μm

按照有效數(shù)字修約原則進行修約，研制的聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)特性量值見表8。

表8 聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)特性量值 μm

3 測量方法驗證

采用掃描電子顯微鏡對中國計量科學(xué)研究院研制的編號為GBW 12031 的國家一級微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)進行測定，共統(tǒng)計1 000 顆顆粒數(shù)據(jù)，計算該標(biāo)準物質(zhì)的數(shù)量平均粒徑、粒徑分布的相對標(biāo)準偏差，結(jié)果見表9。

表9 標(biāo)準物質(zhì)GBW 12031 測定結(jié)果

由表9 可知，測定結(jié)果與標(biāo)準物質(zhì)證書標(biāo)示值基本一致，定值不確定度在給定的范圍內(nèi)，因此采用掃描電子顯微鏡對研制的聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)定值，結(jié)果準確可靠。

4 結(jié)語

采用無皂乳液聚合法和分散聚合一步合成法制備了粒徑分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μm 的8 種規(guī)格的聚苯乙烯微粒粒度標(biāo)準物質(zhì)，經(jīng)場發(fā)射掃描電子顯微鏡及圖像分析軟件對顆粒的直徑進行測量及分析，研制的系列聚苯乙烯微粒標(biāo)準物質(zhì)具有良好的均勻性和穩(wěn)定性，已取得國家二級標(biāo)準物質(zhì)定級鑒定證書。該系列標(biāo)準物質(zhì)既可用于常規(guī)顆粒物在線監(jiān)測儀、粒度分析儀等的校準、檢定，也可以用于后續(xù)環(huán)境模擬艙內(nèi)模擬微生物氣溶膠傳播中的相關(guān)因素研究。