陳雙雙，齊香玉，馮 景，陳慧杰，王華娣,2,秦紫藝,3，鄧衍明,2,3

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 休閑農(nóng)業(yè)研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；2.江蘇大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210014)

繡球(Hydrangea macrophylla)又名八仙花、紫陽花等，為虎耳草科繡球?qū)僦参?。其花序密集且生于花枝頂部，花色豐富，觀賞價(jià)值極高，廣泛應(yīng)用于園林綠化、庭院美化、盆栽等領(lǐng)域；此外，繡球?qū)ν寥浪釅A度非常敏感，可作為測(cè)定土壤酸堿度的指示植物，具有很好的生態(tài)價(jià)值[1-2]。繡球還有較強(qiáng)的鋁耐受和積累能力，部分繡球品種花色可通過調(diào)節(jié)土壤酸堿度和Al3+含量使萼片呈現(xiàn)藍(lán)色[3-4]。大量研究表明，Al3+在繡球花色由紅變藍(lán)過程中起著重要作用；在萼片中，Al3+的積累主要通過鋁離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來實(shí)現(xiàn)，如質(zhì)膜鋁轉(zhuǎn)運(yùn)基因(Plasmamembrane Al transporter，PALT)、液泡膜鋁轉(zhuǎn)運(yùn)基因(Vacuolar Al transporter，VALT)等[5-8]。因此，了解關(guān)鍵基因的表達(dá)方式將有助于闡明繡球花色變化過程中所涉及的分子機(jī)制。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)是檢測(cè)和定量基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式的重要技術(shù)之一，具有高度的敏感性、特異性、可重復(fù)性和準(zhǔn)確性；該技術(shù)還是當(dāng)前檢測(cè)低拷貝數(shù)目的基因轉(zhuǎn)錄水平的唯一方法[9-10]。RNA穩(wěn)定性、質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率、PCR擴(kuò)增效率以及樣本之間的差異，都會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)結(jié)果分析的差異[9,11]。因此，表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)τ谀康幕虮磉_(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化分析至關(guān)重要。最常用的內(nèi)參基因包括α-肌動(dòng)蛋白基因(α-actin gene，ACT)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene，GAPDH)、18S核糖體RNA基因(18S ribosomal RNA gene，18S)、多聚泛素基因(Polyubiquitin gene，UBQ)、泛素結(jié)合酶基因(Ubiquitin conjugating enzyme gene，UBC)、環(huán)葉素基因(Cyclophylin gene，CYC)、延伸因子基因(Elongation factor-1α gene，EF-1α)、維管蛋白基因(Tubulin gene，TUB)等。關(guān)于繡球鋁轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PALT、VALT、NRAT等)表達(dá)分析中，已有研究使用18S作為qRT-PCR的內(nèi)參基因[6-8,12-13]，但對(duì)于18S以及其他常用的內(nèi)參基因如ACT、EF-1α、TUB等在繡球中穩(wěn)定性的表達(dá)分析尚未見報(bào)道。為了獲得準(zhǔn)確的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，有必要為繡球選擇合適的內(nèi)參基因并驗(yàn)證其在特定試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性。

本研究根據(jù)繡球轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出10個(gè)候選內(nèi)參基因[14]，分別是ACT7、β-TUB、EF-1α、18S、UBC23、DnaJ(伴侶蛋白基因)、VPS33(液泡蛋白分選相關(guān)蛋白基因)、TMN12(跨膜超家族成員基因)、UPL7(E3泛素蛋白連接酶基因)、UBP15(泛素羧基末端水解酶基因)，利用geNorm[15]、NormFinder[16]、BestKeeper[17]、ΔCt[18]以及RefFinder[19]5種計(jì)算方法來分析他們?cè)诓煌M織及Al2(SO4)3處理下的表達(dá)穩(wěn)定性。同時(shí)，以繡球鋁轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HmVALT作為目的基因進(jìn)行表達(dá)模式標(biāo)準(zhǔn)化分析，以進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)參基因的可靠性。本研究為進(jìn)一步探索繡球基因表達(dá)分析提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料大花繡球Bailer(商品名：Endless SummerTM，中文名譯為無盡夏，Al2(SO4)3處理后花色可由紅色變?yōu)樗{(lán)色，為鋁敏感品種)和Ruby(中文名譯為紅寶石，Al2(SO4)3處理后保持紅色不變，為不敏感品種)種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院繡球種質(zhì)資源圃內(nèi)。選取長(zhǎng)勢(shì)健壯、無病蟲害的植株進(jìn)行處理，對(duì)照組：澆灌不添加Al2(SO4)3的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(pH 值6.0)，Al2(SO4)3處理組：澆灌添加20 mmol/L Al2(SO4)3的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(pH值 3.0)，每7 d澆灌1次，每個(gè)處理15盆，每個(gè)處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。Bailer花色變化后(約21 d)，分別取2個(gè)品種對(duì)照組與處理組的根、葉、萼片(繡球的觀賞器官主要是萼片)于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取與cDNA合成

取樣品約1 g于液氮中研磨成粉末，采用RN38 EASYspin plus Plant RNA kit (艾德萊)進(jìn)行總RNA提取，具體操作方法參考說明書進(jìn)行。利用Nanadrop-1000和1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA濃度、純度和完整性。cDNA 第一鏈合成采用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考說明書。反應(yīng)產(chǎn)物cDNA保存于-20 ℃。

1.3 候選內(nèi)參基因選擇與引物設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)結(jié)合繡球轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出10個(gè)表達(dá)量穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因，包括5個(gè)傳統(tǒng)內(nèi)參基因(ACT7、β-TUB、EF-1α、18S、UBC23)及5個(gè)新內(nèi)參基因(DnaJ、VPS33、TMN12、UPL7、UBP15)，同時(shí)，選取液泡膜鋁轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(HmVALT)作為鑒定篩選內(nèi)參基因可靠性的目標(biāo)基因(表1)。利用在線引物設(shè)計(jì)程序Primer 3 plus(http://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm)設(shè)計(jì)qPCR引物。參數(shù)設(shè)置如下：Tm值為58～62 ℃，GC含量為45%～60%，產(chǎn)物長(zhǎng)度為150～250 bp。引物由南京思普金生物科技有限公司合成(表1)。

表1 繡球候選內(nèi)參基因相關(guān)信息Tab.1 The primers information of the candidate reference genes and target genes in Hydrangea macrophylla

1.4 qRT-PCR

qRT-PCR反應(yīng)在Real time PCR System 7500上進(jìn)行。反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板2.0 μL，TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)；40個(gè)PCR循環(huán)后，通過熔解曲線分析(60～95 ℃)驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.5 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

將各樣品cDNA混合模板依次稀釋5個(gè)梯度，每個(gè)梯度稀釋5倍(50，5-1，5-2，5-3，5-4)進(jìn)行qRT-PCR。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，用Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并利用公式E=(5-1/slope-1)×100%計(jì)算擴(kuò)增效率。

候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性采用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt 4種程序進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。其中，最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)量采用geNorm軟件對(duì)變異系數(shù)進(jìn)行分析完成。最后，用在線程序RefFinder(https://localhost/RefFinder-master/index.php)綜合分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因引物擴(kuò)增效率分析

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)各引物擴(kuò)增效率進(jìn)行分析，引物的擴(kuò)增效率為90.9%(TMN12)～102.2%(ACT7)，相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient，R2)變化為0.990 7(18S)～0.999 9(UPL7)(表1)。由此可見，所用引物均具有良好的特異性與擴(kuò)增效率，可用于后續(xù)分析。

2.2 候選內(nèi)參基因表達(dá)豐度分析

將10個(gè)候選內(nèi)參基因在不同品種對(duì)照組和處理組不同組織的全部Ct值進(jìn)行匯總，分析它們?cè)谵D(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)豐度的穩(wěn)定性。10個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值分布為16～39，其中，18S(16～21)和ACT7(17～23)的表達(dá)豐度最高，但存在變異；β-TUB(18～23)的表達(dá)豐度也較高，其次是UPL7(21～24)和TMN12(20～26)(圖1)。從Ct值推測(cè)，β-TUB和UPL7可作為候選內(nèi)參基因。

2.3 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.3.1 geNorm分析 geNorm程序通過計(jì)算每個(gè)候選內(nèi)參基因在不同樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性M值來確定其穩(wěn)定性，M值越小表明基因的穩(wěn)定性越高，反之則越低。geNorm程序通常會(huì)將穩(wěn)定性M值低于1.5的候選基因作為內(nèi)參基因。geNorm分析結(jié)果顯示，在所有樣本、不同組織、Bailer、Ruby中10個(gè)內(nèi)參基因的M值均小于1.5，表明這些候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性較好(圖2)。其中，在繡球不同組織中表達(dá)最穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因是UPL7和β-TUB；在Al2(SO4)3處理?xiàng)l件下，Ruby中表達(dá)最穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因同樣是UPL7和β-TUB；而在Al2(SO4)3處理?xiàng)l件下，Bailer中表達(dá)最穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因?yàn)閁PL7和ACT7；當(dāng)綜合考慮所有樣本時(shí)，候選內(nèi)參基因UPL7和β-TUB的M值最小，表達(dá)穩(wěn)定性最好，而EF-1α穩(wěn)定性最差。

geNorm程序還可通過計(jì)算候選內(nèi)參基因的變異系數(shù)(Pairwise variation，Vn/Vn+1)來確定最適的內(nèi)參基因個(gè)數(shù)。通常，以0.15作為臨界值來確定參考基因的最佳數(shù)量。geNorm分析結(jié)果顯示，Al2(SO4)3處理?xiàng)l件下，Bailer和Ruby變異系數(shù)V2/V3(0.106，0.113)小于0.15，表明選擇2個(gè)內(nèi)參基因即可滿足要求；在繡球不同組織中，變異系數(shù)V2/V3(0.161)高于臨界值0.15，而V3/V4(0.143)小于0.15，表明需要3個(gè)內(nèi)參基因(UPL7、β-TUB和VPS33)；而在本研究中考慮所有樣本時(shí)，變異系數(shù)V2/V3為0.131，低于0.15(圖3)。因此，可選用2個(gè)內(nèi)參基因用于Al2(SO4)3處理?xiàng)l件下繡球?qū)崟r(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析。

2.3.2 NormFinder分析 NormFinder程序算法與geNorm類似，通過計(jì)算內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性M值來評(píng)價(jià)基因的表達(dá)穩(wěn)定性，M值越小則表達(dá)穩(wěn)定性越高。NormFinder分析結(jié)果顯示，在Al2(SO4)3處理?xiàng)l件下，Bailer中UPL7(0.154)和β-TUB(0.242)表達(dá)最穩(wěn)定，EF-1α(1.536)表達(dá)最不穩(wěn)定；Ruby中UBP15(0.154)和β-TUB(0.424)表達(dá)最穩(wěn)定，而EF-1α(1.918)表達(dá)最不穩(wěn)定；在不同組織中，UBP15(0.274)和β-TUB(0.455)表達(dá)最穩(wěn)定，EF-1α(1.977)表達(dá)最不穩(wěn)定；在綜合考慮所有樣本時(shí)，同樣是UBP15(0.230)和β-TUB(0.343)表達(dá)最穩(wěn)定，EF-1α(1.799)表達(dá)最不穩(wěn)定(表2)。

表2 NormFinder 表達(dá)穩(wěn)定性分析Tab.2 Stability analysis of expression genes assayed by NormFinder

2.3.3 BestKeeper分析 BestKeeper程序是通過比較候選內(nèi)參基因的Ct值所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差(Standard deviation，s)和變異系數(shù)(Coefficient of variation，CV)來評(píng)價(jià)基因表達(dá)穩(wěn)定性，s和CV值越小則穩(wěn)定性越好，反之則穩(wěn)定性越差。BestKeeper程序分析結(jié)果見表3，在Al2(SO4)3處理?xiàng)l件下，Bailer中DnaJ(s=0.36)、18S(s=0.62)、β-TUB(s=0.80)、VPS33(s=0.84)、UPL7(s=0.89)和UBC23(s=0.99)的s值小于1，Ruby中DnaJ(s=0.54)、VPS33(s=0.71)、UBC23(s=0.73)、UPL7(s=0.79)和β-TUB(s=0.91)的s值小于1，說明這些候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性較好；在不同組織中，比較穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因?yàn)镈naJ(s=0.55)、UPL7(s=0.84)、β-TUB(s=0.87)和VPS33(s=0.87)；在所有樣本中，DnaJ(s=0.46)、VPS33(s=0.84)、β-TUB(s=0.87)和UPL7(s=0.88)表達(dá)穩(wěn)定性最高，EF-1α(s=2.45)穩(wěn)定性最差(表3)。

表3 BestKeeper 表達(dá)穩(wěn)定性分析Tab.3 Expression stability was calculated by BestKeeper

2.3.4 ΔCt分析 ΔCt分析是通過比較候選內(nèi)參基因之間的ΔCt值來評(píng)價(jià)基因穩(wěn)定性的方法。結(jié)果顯示，在Al2(SO4)3處理?xiàng)l件下，Bailer中UPL7和β-TUB表達(dá)最穩(wěn)定，Ruby中UBP15和β-TUB表達(dá)最穩(wěn)定；在不同組織中，β-TUB和UBP15的表達(dá)穩(wěn)定性最好；在所有樣本中，同樣是β-TUB和UBP15的表達(dá)穩(wěn)定性最好，穩(wěn)定性最差的是EF-1α(表4)。

表4 ΔCt表達(dá)穩(wěn)定性分析Tab.4 Expression stability was analyzed by ΔCt

2.3.5 RefFinder分析 geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt 4種程序根據(jù)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排名，結(jié)果存在差異。因此，利用RefFinder方法來建立候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的綜合排名。結(jié)果顯示，在所有樣本中，候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性由高到低依次為：β-TUB>UPL7>UBP15>VPS33>18S>DnaJ>TMN12>UBC23>ACT7>EF-1α(表5、圖4)；在不同組織器官中，候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性由高到低依次為：β-TUB>UBP15>UPL7>VPS33>18S>DnaJ>TMN12>UBC23>ACT7>EF-1α(表6、圖4)；在Al2(SO4)3處理?xiàng)l件下，Bailer中候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性由高到低依次為：UPL7>β-TUB>ACT7>18S>VPS33>DnaJ>UBP15>TMN12>UBC23>EF-1α(表7、圖4)，Ruby中候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性由高到低依次為：β-TUB>UBP15>UPL7>VPS33>DnaJ>UBC23>18S>TMN12>ACT7>EF-1α表達(dá)最穩(wěn)定(表8、圖4)。

表5 RefFinder 表達(dá)穩(wěn)定性分析-所有樣本Tab.5 Stability analysis was calculated by RefFinder-all samples

表6 RefFinder 表達(dá)穩(wěn)定性分析-不同組織Tab.6 Stability analysis was calculated by RefFinder-tissues

表7 RefFinder 表達(dá)穩(wěn)定性分析-BailerTab.7 Stability analysis was calculated by RefFinder-Bailer

2.4 繡球鋁轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選出來的候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，以穩(wěn)定性最好的UPL7、β-TUB以及UPL7+β-TUB分別作為內(nèi)參基因，同時(shí)以穩(wěn)定性最差的EF-1α作為對(duì)照，分析繡球鋁轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HmVALT的表達(dá)模式。結(jié)果如圖5所示，以UPL7、β-TUB以及UPL7+β-TUB分別作為內(nèi)參基因，目的基因HmVALT

表8 RefFinder 表達(dá)穩(wěn)定性分析-RubyTab.8 Stability analysis was calculated by RefFinder-Ruby

在Bailer處理組根和萼片中表達(dá)量最高，且趨勢(shì)一致；而在Ruby中，HmVALT在處理組根中表達(dá)量最高，表達(dá)模式一致。但EF-1α做內(nèi)參基因時(shí)HmVALT的表達(dá)模式卻有別于二者，而且表達(dá)豐度較低。因此UPL7、β-TUB可作為繡球內(nèi)參基因進(jìn)行功能基因的表達(dá)研究。

3 討論與結(jié)論

qRT-PCR因其高靈敏度、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高和定量范圍廣而廣泛應(yīng)用在基因表達(dá)水平分析及基因調(diào)控模式研究中[11]。為了在qRT-PCR分析中獲得可靠、準(zhǔn)確的定量結(jié)果，選擇和驗(yàn)證合適的內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR數(shù)據(jù)分析至關(guān)重要。理想的內(nèi)參基因在不同的發(fā)育階段、不同組織器官以及不同的脅迫條件下都可以穩(wěn)定表達(dá)即產(chǎn)生穩(wěn)定的Ct值。本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)參考篩選出10個(gè)候選內(nèi)參基因，包括5個(gè)傳統(tǒng)內(nèi)參基因(ACT7、β-TUB、EF-1α、18S、UBC23)及5個(gè)新內(nèi)參基因(DnaJ、VPS33、TMN12、UPL7、UBP15)，分析其在不同組織、鋁處理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)定量PCR的表達(dá)穩(wěn)定性。

通過geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt 4種算法，這10個(gè)候選內(nèi)參基因在表達(dá)穩(wěn)定性方面表現(xiàn)各異，4種算法生產(chǎn)的排名順序也不完全相同。本研究中，DanJ在BestKeeper算法中排序最好，即表達(dá)穩(wěn)定性最好，而在geNorm、NormFinder、和ΔCt 3種算法中排序較差；β-TUB、UPL7和UBP15在BestKeeper算法中排序中等，而在其他3種算法中排序較好，表達(dá)穩(wěn)定性好。這些結(jié)果與太陽花、劍麻、朱頂紅等的內(nèi)參基因篩選研究結(jié)果類似，這種排序的不同可能是由不同算法的統(tǒng)計(jì)計(jì)算原理不同所導(dǎo)致[20-22]。RefFinder是一種綜合統(tǒng)計(jì)程序，是綜合分析不同軟件得到的結(jié)果進(jìn)行排名，已被廣泛用于內(nèi)參基因篩選的研究中[20,23-24]?；赗efFinder的綜合分析排名，β-TUB、UPL7和UBP15被認(rèn)為是繡球中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因。因此，RefFinder綜合分析不同程序獲得的結(jié)果可能會(huì)使本研究中候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序的準(zhǔn)確性更高，這表明應(yīng)選用多個(gè)不同的算法對(duì)參考基因進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估。

越來越多的研究表明，常用的內(nèi)參基因在不同的試驗(yàn)條件、不同組織中穩(wěn)定性的表現(xiàn)不同。如劍麻中，內(nèi)參基因β-TUB4、PP2A-1(Protein phosphates 2 gene，蛋白磷酸基因)和RPⅡ(RNA polymeraseⅡ gene，RNA聚合酶基因)在干旱處理?xiàng)l件下是最穩(wěn)定的，β-TUB4、ARF2(ADP-Ribosylation factor 2 gene，ADP-核糖基化因子2基因)和GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)在復(fù)水條件下穩(wěn)定性較好，CYC-A、GAPDH和CUL-1(Cullin gene，泛素化連接酶基因)熱處理后穩(wěn)定性較好，CUL-1、WIN-1和ACT11是冷處理?xiàng)l件下穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因，而鹽處理?xiàng)l件下穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因是β-TUB4、RPⅡ和ARF2[21]；大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系經(jīng)生長(zhǎng)素IAA處理后，穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因是BcTIP41(Tonop last intrinsic proteins，液泡膜內(nèi)在蛋白基因)和ACTIN，而生長(zhǎng)素抑制劑TIBA處理后，UKN1(Hypothetical，假設(shè)蛋白基因)和BcTIP41的穩(wěn)定性較好，UKN1和TUB4在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段表達(dá)最為穩(wěn)定，DnaJ(DnaJ-Like，鋅指蛋白基因)、ACTIN和PP2A是花發(fā)育階段表達(dá)較穩(wěn)定的內(nèi)參基因[25]；GAPDH2是朱頂紅不同組織器官中表達(dá)穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因[22]。在本研究中，β-TUB、UPL7和UBP15是在不同組織中表達(dá)較穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而鋁處理?xiàng)l件下，Bailer和Ruby中表達(dá)穩(wěn)定性較好的基因分別是UPL7、β-TUB、ACT7和β-TUB、UBP15、UPL7。在非模式植物中，與傳統(tǒng)的內(nèi)參基因相比，一些新基因可能表達(dá)出較好的穩(wěn)定性。本研究中，UPL7在繡球中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，其次是UBP15。UPL7可通過調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白的泛素化過程參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理過程，參與植物體內(nèi)重要的蛋白降解途徑。在柑橘中，UPL是研究病毒侵染的內(nèi)參基因[26]；海濱雀稗中，UPL、PP2A和EF-1α組合在干旱處理(PEG)的葉片中穩(wěn)定表達(dá)，是最適的內(nèi)參基因組合[27]。UBP15屬于泛素特異性加工家族，參與蛋白質(zhì)的降解調(diào)節(jié)。楊樹不定根再生階段，UBP被認(rèn)為是最佳的內(nèi)參基因[28]；UBP22在受到或未被白線蟲感染的馬鈴薯植株根中均能穩(wěn)定表達(dá)[29]。因此，不同物種、不同試驗(yàn)條件、不同組織中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性存在一定差異，在進(jìn)行目的基因表達(dá)分析之前，需對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。

當(dāng)在特定的試驗(yàn)條件下，選擇2個(gè)或者多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行目的基因表達(dá)量分析時(shí)，結(jié)果更加可靠、準(zhǔn)確[24-25,30]。geNorm程序可以用于確定穩(wěn)定內(nèi)參基因最佳數(shù)量，以進(jìn)行準(zhǔn)確的基因表達(dá)分析。通常，以0.15(Vn/Vn+1)作為臨界值用于計(jì)算內(nèi)參基因的最佳組合。本研究中，Al2(SO4)3處理?xiàng)l件下，Bailer和Ruby以及所有樣本的變異系數(shù)(V2/V3)分別為0.106，0.113，0.131均小于0.15，表明在鋁處理?xiàng)l件下，選用2個(gè)內(nèi)參基因足以分析目的基因的表達(dá)量；而在不同組織的分析中，變異系數(shù)V2/V3為0.161，大于0.15，V3/V4為0.143，可能需要3個(gè)內(nèi)參基因才能滿足需求，而導(dǎo)致這種變異的原因可能是材料來源的不同。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，2個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)參基因足以滿足目的基因表達(dá)研究的需求[21-22,25,30]。結(jié)合qRT-PCR Ct值分析，UBP15Ct值相對(duì)較高，因此，鋁處理?xiàng)l件下繡球較合適的內(nèi)參基因?yàn)棣?TUB和UPL7。

通過研究Al2(SO4)3處理?xiàng)l件下鋁轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HmVALT作為靶基因的表達(dá)譜，進(jìn)一步驗(yàn)證了鑒定出的最穩(wěn)定(β-TUB和UPL7)和最不穩(wěn)定(EF-1α)的內(nèi)參基因的可靠性。使用最穩(wěn)定的基因做內(nèi)參基因時(shí)，目的基因HmVALT的表達(dá)豐度較高且表達(dá)模式一致，而不穩(wěn)定的EF-1α作內(nèi)參基因時(shí)，HmVALT的表達(dá)模式出現(xiàn)變化且HmVALT的表達(dá)豐度相對(duì)降低。這些結(jié)果說明，選擇合適內(nèi)參基因?qū)τ诜治瞿康幕虮磉_(dá)變化至關(guān)重要。

本研究基于qRT-PCR對(duì)繡球鋁處理?xiàng)l件下的內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選，確定β-TUB和UPL7為最適的內(nèi)參基因。研究結(jié)果為后續(xù)開展繡球功能基因表達(dá)分析奠定了理論基礎(chǔ)。