王江林，王 永，孟慶勇，朱江江，林亞秋

(1.西南民族大學(xué)，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部、四川省重點實驗室，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京 100193)

隨著羊肉在人們?nèi)馄废M中占據(jù)越來越高的地位，人們對羊肉品質(zhì)的要求也達到了新的水平，影響肉質(zhì)性狀的重要因素是動物體內(nèi)脂肪組織的分布，而前體脂肪細胞的分化是動物脂肪沉積的主要方式。前體脂肪細胞的分化是一個多轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用的復(fù)雜生物過程[1]，伴隨著細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的變化，越來越多的研究表明，Krupprl樣因子家族(Kruppel-like factors，KLFs)能夠獨立或者協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控脂肪細胞分化[2-3]。研究KLFs基因?qū)χ炯毎只恼{(diào)控作用和闡明其影響山羊肉質(zhì)性狀的分子機制具有重要意義。

KLFs是一類在真核生物體內(nèi)廣泛分布的重要鋅指蛋白[3-5]，其功能復(fù)雜多樣。目前共發(fā)現(xiàn)KLFs家族成員有18個，成員間存在直接或間接相互作用，在不同的生物過程中都發(fā)揮重要調(diào)控功能[6-7]。已有研究證明KLFs家族有多個成員參與脂肪分化中，并發(fā)揮重要的作用[8-10]。KLF6是KLFs家族中的重要一員，最早從小鼠和人的肝臟星形間葉細胞和胎盤中獲得[11]，KLF6作為轉(zhuǎn)錄因子，可能通過結(jié)合基因的啟動子來調(diào)控靶基因的表達[12]。近年在小鼠上研究表明，KLF6參與到前體脂肪細胞分化及脂質(zhì)代謝過程中[9]。Li等[10]在3T3-L1細胞的研究中發(fā)現(xiàn)KLF6可能通過抑制DLK1來促進脂肪細胞分化，Bechmann等[13]研究發(fā)現(xiàn)KLF6增加了PPARα的活性，而敲除KLF6則抑制PPARα活性。其中PPARα是參與脂肪細胞分化過程的重要的核受體類轉(zhuǎn)錄因子[14]。以上研究皆暗示KLF6在脂肪細胞分化中具有重要的調(diào)控作用，然而KLF6在家畜中的相關(guān)報道較少，同時西南民族大學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)國家民委重點實驗室前期轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)KLF6是山羊脂肪細胞分化前后的主要差異基因之一。

本研究克隆得到簡州大耳羊KLF6核苷酸序列并利用實時熒光定量PCR(Quantitative real time PCR，qPCR)等技術(shù)明確該基因的組織和細胞時序表達模式，本研究結(jié)果為最終闡明其對山羊脂肪細胞分化的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物與組織的采集 試驗動物選擇生長12月左右(n=4)健康簡州大耳羊，自四川省簡陽市大哥大牧業(yè)有限公司購得。清晨空腹屠宰后，當(dāng)即剪取心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌、皮下脂肪、腹間脂肪、大腸、小腸、瘤胃、胰臟等組織樣品，將樣品在DEPC水中清洗后，快速用錫紙包好并分裝在標好編號的凍存管內(nèi)置于液氮中保存。

1.1.2 試驗材料 TRIzol試劑、pMD-19T Vector載體及SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)試劑盒通過TaKaRa公司訂購；通過Thermo公司購得反轉(zhuǎn)錄(Revert Aid First Strand cDNA SynthesisKit)試劑盒；DH5α感受態(tài)細胞與2×GC-rich PCR Master Mix通過北京天根生化科技有限公司購得；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒通過Axygen公司購得；雙抗、PBS、胰蛋白酶及DEME/F12培養(yǎng)基通過Hyclone公司供售；胎牛血清通過Gemini公司購得；油酸通過Sigma公司購得；細胞培養(yǎng)皿等耗材由依科賽生物制品有限公司供售；氯仿、異丙醇、DEPC及其他試劑則為國產(chǎn)生化試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 按照TRIzol法提取各組織及細胞總RNA，檢測RNA完整性、RNA濃度及純度，利用紫外分光光度計測定OD值在1.8～2.0，符合試驗要求。所提取RNA去除基因組DNA并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 山羊KLF6基因的克隆測序 根據(jù)GenBank上登錄的山羊、綿羊、牛的KLF6基因預(yù)測序列，利用Primer Primer 5.0軟件在其序列比對保守區(qū)域，設(shè)計得到PCR特異性擴增引物(表1)，引物由成都擎科(成都)生物公司合成，并以脂肪組織cDNA為

表1 引物信息Tab.1 Primers information

模板克隆KLF6基因PCR反應(yīng)體系為Tap PCR Master Mix(2×)12.5 μL、Primer F(10 μmoL/L)1.0 μL、Primer R(10 μmoL/L)1.0 μL、模板cDNA 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL，反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測為所需目的條帶，并通過AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒回收目的條帶，構(gòu)建PMD-19T-KLF6連接載體，并在DH5α感受態(tài)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化，37 ℃培養(yǎng)13～16 h，挑取陽性克隆，并進行菌落PCR鑒定，最后送成都擎科(成都)公司進行序列測定。

1.2.3 山羊KLF6基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI 網(wǎng)站上ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析KLF6基因的開放閱讀框，通過Blast在線工具進行同源性比較，利用MEGA 7軟件進行KLF6基因物種進化樹分析；利用ExPASY(http://www.expasy.org)分析推導(dǎo)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域，利用SignalP 4.1 Server預(yù)測信號肽序列，利用NetPhos 2.0、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0分析預(yù)測KLF6蛋白磷酸化位點、O 糖基化位點、N 糖基化位點，通過PSORT II(http://psort.hgc.jp/)對亞細胞定位進行預(yù)測，相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)由STRING(http://www.string-db.org/)交互式數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，NPS預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)。

1.2.4 山羊KLF6基因組織表達檢測 根據(jù)克隆獲得的山羊KLF6序列設(shè)計其定量引物，檢測KLF6基因在簡州大耳羊各組織(心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌、皮下脂肪、腹間脂肪、瘤胃和胰腺)中的表達差異。qPCR反應(yīng)體系為SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μL、Primer F(10 μmoL/L)1.0 μL、Primer R(10 μmoL/L)1.0 μL、模板cDNA 1.0 μL，ddH2O 7 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)。試驗設(shè)置4個生物學(xué)及3個技術(shù)重復(fù)，并設(shè)置陰性對照，引物序列見表1。

1.2.5 山羊KLF6基因時序表達檢測 取本實驗保存[15]的山羊皮下脂肪細胞進行復(fù)蘇培養(yǎng)，加入適量完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清，90%DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10 kU/L青鏈霉素)培養(yǎng)，按照1∶3傳代接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 d換一次液。將F3細胞傳代至12孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長至80%時，利用含10 mg/L 胰島素和150 μmol/L油酸的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至不同時間收集用于檢測KLF6基因在分化過程中的表達情況。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標準差”表示，用2-ΔΔCt法[16]對qPCR數(shù)據(jù)均一化處理，組織表達以心臟組織為對照，以TBP[17]為內(nèi)參基因，細胞試驗以0 d為對照，以UXT[18]為內(nèi)參基因(表1)。顯著性檢驗利用SPSS 22.0軟件中One-way ANOVA分析，當(dāng)P<0.05，則差異顯著，當(dāng)P<0.01時，則差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊KLF6基因的克隆及理化性質(zhì)分析

利用RT-PCR方法，以簡州大耳羊脂肪組織cDNA為模板克隆得到KLF6核苷酸序列，序列總長為1 233 bp，其中包含ORF區(qū)957 bp，5′UTR序列123 bp，3′UTR序列153 bp，其終止密碼子為TGA，編碼318個氨基酸殘基(圖1)。山羊KLF6氨基酸序列的理化性質(zhì)預(yù)測顯示，該蛋白分子式為C1532H2354N442O488S16，其蛋白分子量為35.285 17 ku，理論等電點為6.20，不穩(wěn)定指數(shù)為47.72，親水性總平均值為-0.731，說明該蛋白為親水酸性蛋白。氨基酸組成顯示絲氨酸(Ser)占13.8%，為組成氨基酸比例最高(圖2)，帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為42，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為36，因此該蛋白整體帶負電。

2.2 山羊KLF6生物信息學(xué)分析

磷酸化位點預(yù)測結(jié)果顯示，山羊KLF6蛋白潛在的磷酸化位點共53個，其中酪氨酸(Tyr)、絲氨酸(Ser)及蘇氨酸(Thr)磷酸化位點的個數(shù)分別為5，37，11，有20個O-糖基化位點，分別為8個蘇氨酸糖(Thr)基化位點和12個絲氨酸(Ser)糖基化位點，存在1個N-糖基化位點(圖1)；同時分析發(fā)現(xiàn)山羊KLF6蛋白無信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域，其主要功能位于細胞核(95.7%)，其次是液泡(4.3%)。KLF6蛋白結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示(圖3-A)，其可能由總氨基酸的19.18%(61個氨基酸)形成α-螺旋、12.26%(39個氨基酸)形成延伸鏈及68.55%(218個氨基酸)形成無規(guī)則卷曲(圖3-B)。KLF6具有典型的鋅指(C2H2)結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)域由3個鋅指殘基構(gòu)成，分別定位于235-259，265-289和295-317(圖1)，三維結(jié)構(gòu)也顯示了鋅指家族的典型特征(圖3-C)。蛋白相互作用分析發(fā)現(xiàn)，KLF6蛋白可能和SART1、JUN、ATF3、RAB5A、PA2G4、ST13、CDK2AP1等蛋白存在相互作用(圖4)。

2.3 山羊KLF6同源比較及進化樹構(gòu)建

利用NCBI在線比對程序Blast，將獲得的山羊KLF6核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)，山羊KLF6核苷酸序列與綿羊、牛和印度水牛的同源性最高，分別為99.6%，98.5%和98.1%(圖5-A)。將獲得的山羊KLF6氨基酸序列與其他動物的預(yù)測氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)與綿羊、牛和印度水牛的氨基酸序列同源性最高，皆達到99.6%以上，而與大鼠、豬、小鼠、野駱駝、馬、獼猴、人、雞的同源性依次是87.4%，86.4%，86.2%，86.1%，85.5%，83.6%，83.3%，77.3%，表明KLF6在哺乳動物中高度保守，同時利用MEGA 7.0軟件將各物種的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹(圖5-B)。

2.4 山羊KLF6基因組織表達差異分析

為探討KLF6基因在山羊組織中的表達情況，本研究利用qPCR技術(shù)檢測了山羊14個組織中KLF6基因的mRNA表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖6)，KLF6基因在山羊各組織中廣泛表達，并在山羊腹脂中的表達極顯著高于其他各個組織(P<0.01)，其次是皮脂和肺臟中，而在瘤胃和胰腺中表達最低。

2.5 山羊KLF6基因時序表達差異分析

為進一步驗證KLF6在脂肪中的調(diào)控作用，本研究檢測KLF6在山羊皮下脂肪細胞分化不同階段的mRNA水平，并以0 h的表達為對照，qPCR檢測結(jié)果顯示(圖7)，在皮下脂肪細胞分化中，KLF6的相對表達量在分化0～24 h變化不顯著，在分化24～96 h呈先上升后下降的趨勢極顯著上升(P<0.01)，并在60 h達到峰值。

3 討論與結(jié)論

KLF6基因作為KLFs中的重要一員，在哺乳動物中KLF6也被確定為調(diào)控脂肪分化、脂肪形成和肥胖轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分[14]，本試驗成功克隆獲得山羊KLF6基因序列1 233 bp，其中包含CDS區(qū)957 bp，編碼318個氨基酸，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其具有多個磷酸位點及糖基化位點，而蛋白質(zhì)翻譯后修飾有磷酸化和糖基化等方式[19]，推測這些位點是KLF6蛋白翻譯后的關(guān)鍵修飾位點，以保證KLF6蛋白能夠發(fā)揮正常功能。KLF6蛋白無信號肽剪切點和跨膜結(jié)構(gòu)域，主要在細胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用，這與其調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的發(fā)生場所一致。且KLF6蛋白含有3個鋅指結(jié)構(gòu)，分別定位在235-259,265-289和295-317位點處，這與KLFs蛋白具有3個高度同源的C-端鋅指(C2H2)結(jié)構(gòu)的報道一致[20]，有研究表明，這些結(jié)構(gòu)域能夠有效地結(jié)合DNA分子上富含GC的序列(GC盒或CACCC元件)[21]，或者與蛋白質(zhì)互作發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[22]。KLF6的核苷酸序列及氨基酸序列與綿羊和牛的親緣關(guān)系最近，其次是豬和大鼠，表明反芻動物KLF6基因的進化來源可能具有同一性，在生物學(xué)功能上存在較小的差異。KLF6蛋白相互作用分析預(yù)測其可能與ATF3、PA2G4及JUN等蛋白存在相互作用，研究顯示KLF6能夠直接結(jié)合并激活A(yù)TF3啟動子進而誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡[23]，KLF6還通過ATF4-ATF3-CHOP途徑參與細胞增殖和凋亡的調(diào)控[24]，同時侯巧燕等[25]的研究顯示，在抑制癌細胞的增殖過程中KLF6與JUN存在拮抗作用。

本研究進一步明確了KLF6的組織表達規(guī)律，結(jié)果顯示，該基因在山羊組織中廣泛表達，并在山羊腹脂中極顯著高于其他各個組織，其次是皮脂和肺臟。Chi等[26]在藏雞中研究發(fā)現(xiàn)KLF6在肺臟中高表達，在藏山羊中發(fā)現(xiàn)在肺臟、脾臟及脂肪組織中有較高表達[27]，朱江江等[28]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛中KLF6高表達與肺臟和皮下脂肪，這與本研究存在相似及不同之處，該基因在青藏高原物種中的肺組織高表達，推測其可能與高原物種氧濃度適應(yīng)有關(guān)。賈魯?shù)萚29]研究指出，KLF6在大黃魚的腎、肝組織中高表達，推測該基因的組織表達具有物種差異性。

基于KLF6基因在山羊脂肪組織中高表達的結(jié)果，推測其預(yù)示著其可能參與脂肪沉積，為了進一步的確定該推測，本研究檢測了KLF6在山羊皮下脂肪細胞分化不同階段的mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山羊KLF6基因在皮下脂肪細胞分化60 h的表達水平極顯著高于前體脂肪細胞的表達水平。這與KLF6在3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中相似的表達模式[10]，根據(jù)KLF6在分化前后的山羊皮下脂肪細胞分化中的表達水平及結(jié)合在3T3-L1中的研究結(jié)果，推測KLF6基因促進山羊脂肪細胞分化。而KLF6對山羊脂肪細胞分化的具體調(diào)控作用及調(diào)控機制，則需要利用過表達、干擾和信號通路等方法和途徑來進一步闡明。

本研究克隆得到山羊KLF6基因序列1 233 bp，其中CDS序列957 bp，編碼318個氨基酸殘基，具有3個典型鋅指。KLF6基因在山羊脂肪組織中高表達。KLF6在分化60 h的山羊皮下脂肪細胞中的表達水平極顯著高于前體脂肪細胞中的表達水平。結(jié)果將為解析山羊KLF6基因的功能以及其在脂肪細胞分化中的調(diào)控作用奠定理論基礎(chǔ)。