楊柳青，殷 實(shí),4,秦文昌，袁鈺潔，李 鍵

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；3.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；4.西南民族大學(xué) 現(xiàn)代生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

Sirtuin7(SIRT7)是Ⅲ類組蛋白去乙?；?Histone deacetylases, HDACs)中的一個(gè)成員[1]，最早從人脾cDNA文庫(kù)中克隆出，定位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂25區(qū)3帶(17q25.3)[2]，其催化活性依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotine adenine dinucleotide, NAD+)[3-4]。SIRT7參與去乙?；倪^程分為2步：首先SIRT7將NAD+分解為煙酰胺(Nicotinamide, NAM)，然后將乙?；鶑牡孜镛D(zhuǎn)移到NAD+的ADP-核糖基團(tuán)上，形成2-O-乙酰-ADP-核糖和去乙酰化的底物[5-6]。SIRT7除了去乙?；富钚酝?，還具有其他的酶活性，如去琥珀?；?、去丁酰化、去豆蔻?；萚7-8]。

SIRT7具有的酶活性使其在細(xì)胞內(nèi)具有生物學(xué)功能的多樣性。SIRT7通過去乙?；M蛋白底物和非組蛋白底物，在細(xì)胞內(nèi)參與DNA損傷修復(fù)、抑制癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞衰老等過程。SIRT7通過去乙?；疕3K18，降低DNA損傷位點(diǎn)H3K18Ac水平，促進(jìn)損傷反應(yīng)因子p53結(jié)合蛋白1(p53-binding proteins 1, 53BP1)與染色質(zhì)的結(jié)合，阻止DNA復(fù)制，從而提高非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ) DNA修復(fù)效率[9]。SIRT7通過去乙酰化WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域77(WD repeat domain 77, WDR77)，干擾WDR77與精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(Protein arginine methyltransferase 5, PRMT5)的相互作用，從而抑制癌細(xì)胞的增殖[10]。SIRT7還能將核仁磷酸蛋白(Recombinant nucleophosmin 1, NPM1)去乙?；鰪?qiáng)人體抑癌基因(P53)的轉(zhuǎn)錄活性并誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[11]。除了去乙酰化，SIRT7可將H3K122去琥珀?；?，參與調(diào)節(jié)DNA修復(fù)中發(fā)生的染色質(zhì)重塑過程，從而維持基因組的穩(wěn)定性[12]。

Gao等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，在敲除SIRT7的小鼠卵母細(xì)胞中GA結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子β1(GA binding protein transcription factor beta1, GABPβ1)乙?；缴撸珹TP的含量與對(duì)照組相比減少約40%，且線粒體中ROS的水平顯著升高，表明缺少SIRT7的卵母細(xì)胞中線粒體的供能功能受損[13]。此外，他們還發(fā)現(xiàn)在肥胖小鼠的卵母細(xì)胞中，SIRT7蛋白水平較正常小鼠低，上調(diào)SIRT7的表達(dá)能夠保護(hù)卵母細(xì)胞免受母體肥胖相關(guān)的氧化應(yīng)激和減數(shù)分裂缺陷的影響。SIRT7通過去乙?；疪as相關(guān)的核抗原(Ras-related nuclear antigen, RNA)，調(diào)控核因子kB p65(Nuclear factor-kappa B p65, NF-kB p65)從核中輸出，從而抑制卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)凋亡的拮抗作用[14]。這些結(jié)果表明,SIRT7通過去乙?；诼殉仓邪l(fā)揮著重要作用。

牦牛(Bosgrunniens)作為青藏高原的主要畜種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，然而其繁殖力較低，流產(chǎn)率較高等缺點(diǎn)限制了牦牛的生產(chǎn)性能[15]。目前，有關(guān)SIRT7的研究多集中在人和鼠上，鮮有家畜上的研究。本試驗(yàn)以成年牦牛為研究對(duì)象，克隆了牦牛SIRT7基因的整個(gè)CDS區(qū)并預(yù)測(cè)了其所編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能。同時(shí)檢測(cè)了SIRT7基因在牦牛各組織和不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)。本研究為深入研究SIRT7基因在牦牛生殖繁育過程中的作用提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

試驗(yàn)所使用的組織樣本均來自于四川盛龍食品有限公司的屠宰場(chǎng)。采集成年牦牛(3～5歲)的肝臟、乳腺、大腸、腎等組織及其處于卵泡期(卵巢內(nèi)有許多囊狀卵泡)、紅體期(卵泡外膜破裂,卵泡腔充滿血液,顏色呈鮮紅色或紫紅色)、黃體期(黃體突出于卵巢表面,呈黃色)的卵巢，來源于3頭牦牛的同一種組織被視為生物學(xué)重復(fù)。所采集的樣本經(jīng)生理鹽水清洗后，用經(jīng)消毒的外科手術(shù)剪剪成小塊裝入2 mL凍存管中，標(biāo)記好樣品名稱及采集時(shí)間后立即置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑及儀器

TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；Premix TapTMDNA聚合酶、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit(100)膠回收試劑盒購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司；NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(gDNA Purge)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Novoprotein；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 總RNA提取及cDNA制備

TRIzol法提取組織總RNA。核酸分析儀測(cè)定RNA濃度及純度，A260/280比值在1.8～2.0的RNA樣品可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟對(duì)合格RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA于-20 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄體系20 μL:RNA樣品1 μL，gDNA Purge 1 μL， 2×NovoScript? Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 10 μL，RNase Free Water 8 μL。反應(yīng)條件：50 ℃孵育30 min，75 ℃孵育5 min，4 ℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

克隆引物的設(shè)計(jì)依據(jù)GenBank中登錄的黃牛SIRT7基因序列(登錄號(hào)：XM_019981494.1)并通過Primer Premier 5設(shè)計(jì)完成(表1)。定量引物的設(shè)計(jì)依據(jù)GenBank中登錄的黃牛SIRT7(登錄號(hào)同上)及ACTB(登錄號(hào)：AY141970.1)并通過NCBI中的Pick Primers設(shè)計(jì)完成(表1)，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.5 PCR擴(kuò)增及克隆

以牦牛黃體組織cDNA為模板，通過普通PCR進(jìn)行SIRT7基因的擴(kuò)增克隆。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板cDNA及上、下游引物各1 μL，Premix TapTMDNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，61 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。完成凝膠電泳檢測(cè)后，在紫外下，將目的條帶切割置于1.5 mL離心管中，使用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收?；厥蘸蟮腄NA產(chǎn)物，與載體pMDTM19-T于16 ℃連接15 h后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)LB固體培養(yǎng)基(Amp+)于37 ℃培養(yǎng)12 h后，再于LB液體培養(yǎng)基(Amp+)中接種挑取的白色單菌落，搖床培養(yǎng)6 h后，通過PCR對(duì)菌液進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性菌液交由生工生物(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

牦牛各組織(其中卵巢組織為處于卵泡期的卵巢)及不同發(fā)情時(shí)期卵巢的cDNA為模板，ACTB為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SIRT7mRNA的表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系為15 μL：模板cDNA 及上、下游引物各1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，ddH2O 5.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；以0.5 ℃/10 s的速度從62 ℃增溫至98 ℃。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.7 生物信息學(xué)分析

通過DNAMAN 9對(duì)測(cè)序所獲得的牦牛SIRT7基因序列進(jìn)行拼接，并進(jìn)行同源性比對(duì)。使用NCBI中的在線軟件ORF Finder確定開放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列。使用DNASTAR 7.1和ExPASY工具包中的SWISS-MODEL分別預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用ExPASY工具包中的ProtParam、SignaIP 5.0 Sever、TMHMM 2.0、NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0 Server、NetNGlyc 1.0 server分別分析蛋白理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2-ΔΔCt方法分析qRT-PCR結(jié)果，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析差異顯著性。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差形式表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛SIRT7基因克隆及同源性分析

PCR擴(kuò)增獲得的目的產(chǎn)物條帶長(zhǎng)1 376 bp(圖1)，與設(shè)計(jì)的SIRT7克隆引物結(jié)果一致。SIRT7的開放閱讀框大小為1 203 bp，編碼400個(gè)氨基酸(圖2)。開放閱讀框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。

牦牛的SIRT7基因序列與其他9種哺乳動(dòng)物的SIRT7基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)(表2)，結(jié)果表明，牦牛SIRT7基因序列與黃牛SIRT7基因序列的同源性最高，為99.4%，與其他物種的SIRT7基因序列同源性也都在90%以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)結(jié)果表明，牦牛與黃牛的親緣關(guān)系最近。

表2 牦牛與其他物種SIRT7基因的同源性對(duì)比Tab.2 Alignment of SIRT7 gene sequences between yak and other species

2.2 牦牛SIRT7蛋白結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)

SIRT7蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為45.04 ku，分子式為C1943H3176N614O583S18，等電點(diǎn)、脂肪族系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)分別為9.63，77.33，61.9。SIRT7蛋白氨基酸組成如表3，所含氨基酸中Arg、Leu、Glu含量較高，分別為11.5%，11.0%，8.2%。SIRT7蛋白中帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)和帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)數(shù)量分別為68，49個(gè)，由此可知，SIRT7蛋白整體上帶正電荷。總平均親水性為-0.664，該蛋白為親水性蛋白。無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。

SIRT7蛋白存在38個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中12個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)，22個(gè)絲氨酸位點(diǎn)，4個(gè)酪氨酸位點(diǎn)(圖4)。此外，SIRT7蛋白還含有24個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。

表3 牦牛SIRT7蛋白氨基酸組成Tab.3 The amino acids composition of yak SIRT7 protein

牦牛SIRT7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)由α-螺旋(47.4%)、β-折疊(29.7%)、β-轉(zhuǎn)角(15.7%)及無規(guī)卷曲(7.2%)組成，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)相一致(圖6)。

2.3 牦牛SIRT7 mRNA組織表達(dá)譜

以肌肉為參照，SIRT7mRNA在牦牛各組織中廣泛表達(dá)(圖7)，表達(dá)量最高的組織為腎，且顯著高于其他組織(P<0.05)，乳腺、大腸、肝臟、心臟中表達(dá)量次之，卵巢及肌肉中表達(dá)量相對(duì)較低。

2.4 牦牛SIRT7 mRNA在不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的組織表達(dá)譜

以卵泡期卵巢為參照，對(duì)不同發(fā)情時(shí)期卵巢中SIRT7mRNA的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，SIRT7mRNA在牦牛的卵泡期、紅體期和黃體期卵巢中的表達(dá)量呈逐漸上升的趨勢(shì)，且各時(shí)期之間的表達(dá)達(dá)到顯著水平(P<0.05)，黃體期的表達(dá)量最高(圖8)。

3 討論與結(jié)論

SIRT7蛋白是一種沉默調(diào)節(jié)蛋白，可將啟動(dòng)子上已乙?；慕M蛋白H3K18和H3K36去乙酰化，而H3K18和H3K36的去乙?；c基因組穩(wěn)定性有關(guān)[16-18]。除了組蛋白去乙?；?，SIRT7還可與各種非組蛋白(P53、U3-55k)相互作用，從而參與調(diào)控人類衰老和癌癥等多種生理及病理過程[19-21]。已有相關(guān)研究證實(shí)SIRT7的去乙酰化與小鼠的卵巢功能具有密切的聯(lián)系[13]。基于目前對(duì)牦牛SIRT7基因的研究較少，本試驗(yàn)克隆了牦牛SIRT7基因，預(yù)測(cè)了其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，并檢測(cè)了SIRT7mRNA在各組織及不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)。

本試驗(yàn)成功克隆了牦牛SIRT7基因的CDS區(qū)。序列比對(duì)結(jié)果表明，牦牛SIRT7基因序列與黃牛SIRT7基因序列的同源性最高，為99.4%，與其他物種的SIRT7基因序列同源性也都在90%以上，表明SIRT7基因在哺乳動(dòng)物進(jìn)化的過程中高度保守。磷酸化及糖基化預(yù)測(cè)結(jié)果表明，牦牛SIRT7蛋白有多個(gè)磷酸化及糖基化位點(diǎn)，說明該蛋白可能受到翻譯后修飾的調(diào)控。SIRT7在其C-末端區(qū)域(氨基酸344-348)具有細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)磷酸化位點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)，SIRT7在有絲分裂過程中通過CDK1-cyclinB途徑直接或間接被磷酸化，磷酸化后導(dǎo)致SIRT7 C-末端區(qū)域的構(gòu)象改變，SIRT7磷酸化后的狀態(tài)降低了抗體對(duì)SIRT7 C-末端區(qū)域的反應(yīng)性[22]。目前，關(guān)于SIRT7蛋白的糖基化功能未見報(bào)道。本研究針對(duì)牦牛SIRT7蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)于未來研究SIRT7蛋白的功能具有一定的幫助。

本試驗(yàn)檢測(cè)了SIRT7mRNA在牦牛各組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，SIRT7的mRNA廣泛表達(dá)于各組織，在腎及乳腺中表達(dá)較高。SIRT7通過去乙?；闲」芡鈧?cè)膜上的鉀氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Recombinant potassium chloride cotransporters 4, KCC4)，維持腎臟集合管室的pH值的平衡[23]。乳腺的泌乳功能與雌性動(dòng)物的生育直接相關(guān)，已有研究表明，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)SIRT7，可顯著提高乳脂合成關(guān)鍵因子過氧化物酶增殖體激活受體γ(Peroxisome proliferators-activated receptorsγ,PPARγ)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(Sterolregulatory element-bindingproteinl, SREBP1)的表達(dá)[24]。而關(guān)于SIRT7是否調(diào)控牦牛的腎臟及乳腺發(fā)育這一科學(xué)問題還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在牦牛卵巢中，卵泡期、紅體期、黃體期SIRT7mRNA的表達(dá)量呈明顯的升高趨勢(shì)，其中黃體期表達(dá)量最高，提示SIRT7可能在牦牛黃體的形成過程中發(fā)揮重要作用。牦牛黃體形成過程中在細(xì)胞層面最主要的變化是細(xì)胞胞質(zhì)中線粒體數(shù)量增多及脂質(zhì)代謝增強(qiáng)[25]。SIRT7的第388位精氨酸(R388)被蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶6(Protein arginine methyltransferases 6, PRMT6)甲基化后，抑制了SIRT7的H3K18去乙酰化酶活性，R388的甲基化可促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，SIRT7通過與SIRT1結(jié)合而阻止SIRT7發(fā)揮去乙?；富钚?，從而促進(jìn)脂肪的合成[27]。肝臟特異性敲除SIRT7的小鼠，即使喂養(yǎng)高脂肪的食物，小鼠體質(zhì)量保持不變，說明SIRT7的存在與脂質(zhì)的合成有關(guān)[28]。以此推測(cè)SIRT7可能通過調(diào)控顆粒細(xì)胞黃體化過程中線粒體的合成和脂質(zhì)代謝進(jìn)而影響牦牛的卵巢功能。關(guān)于SIRT7在卵巢活動(dòng)中的具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

本研究成功克隆了牦牛SIRT7基因，開放閱讀框大小為1 203 bp，編碼氨基酸400個(gè)，牦牛SIRT7蛋白是一個(gè)無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性蛋白，其編碼區(qū)在生物進(jìn)化過程中高度保守，且具有多個(gè)磷酸化和糖基化位點(diǎn)。SIRT7mRNA在腎及乳腺中高表達(dá)，在牦牛卵巢中，卵泡期、紅體期、黃體期SIRT7mRNA的表達(dá)量呈持續(xù)升高的趨勢(shì)，其中黃體期表達(dá)量最高。本試驗(yàn)為研究SIRT7在雌性生殖系統(tǒng)中的作用及提高牦牛的繁殖性能提供一定的理論支持。