李世舉，王艷旭，邱建敏，吳松鷹，鐘曉勇，施方圓

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003；

2.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州350004；3.莆田市第一醫(yī)院，福建 莆田351100）

實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的動物模型。炎癥狀態(tài)下，無法區(qū)分中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的小膠質(zhì)細胞及血液來源的巨噬細胞，兩者形態(tài)及細胞表面標志物一樣，統(tǒng)稱小膠質(zhì)／巨噬細胞?；罨癄顟B(tài)的小膠質(zhì)／巨噬細胞有2種類型，即M1型及M2型，M1型促進炎癥反應，M2型減輕炎癥反應［1-3］。M1型分子標志物有CD80、CD86等，釋放TNF-α等促炎因子［1］，M2型分子標志物有CD206、Arg-1等，分泌TGF-β等抗炎因子［1］。近來的研究表明，MS患者小膠質(zhì)／巨噬細胞向M1型極化，加劇中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應，使病情惡化［1］。我們前期研究［4］發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，Tri）對EAE有治療作用，但機制尚未明確。本研究旨在觀察Tri對EAE小鼠小膠質(zhì)／巨噬細胞M1／M2極化的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級雌性SJL／J小鼠60只，8～10周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK（京）2019-0009，合格證編號：110011210103100654。飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學實驗動物中心，使用許可證號：SYXK(閩）2016-0006，恒溫恒濕，控制室溫22℃，相對濕度50%，明暗各12 h，自由取食標準飼料和飲水，動物適應環(huán)境3 d后分組實驗。

1.2 主要藥物及試劑 雷公藤內(nèi)酯醇（福建醫(yī)學科學研究所）；蘇木精、伊紅染色劑（北京經(jīng)科化學試劑經(jīng)營公司）；髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白139-151（PLP139-151，美國Eurogentec公司）；完全弗氏佐劑（含滅活牛型結核桿菌1 mg／mL）、百日咳毒素均購自美國Sigma公司；滅活牛型結核桿菌（上海生物制品研究所，1 mL約含100 mg）；兔抗鼠CD80一抗，兔抗鼠CD206一抗，Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔二抗，DAPI、TNF-α、TGF-β1 ELISA試劑盒（美國Invitrogen公司）；OCT包埋劑（美國Sakura公司）。

1.3 實驗儀器 CM1950冰凍切片機、RM2245石蠟切片機（德國LEICA公司）；BX43光學顯微鏡、BX58正置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；SUNRISEBASIC酶標儀（瑞士TECAN公司）。

2 實驗方法

2.1 分組及模型的建立 小鼠采用隨機數(shù)字法分為對照組、模型組、Tri組，每組各20只。參照Xie C等［5］的方法，將PLP139-151、完全弗氏佐劑、滅活結核桿菌混合，充分乳化制成誘導乳劑。模型組、Tri組免疫的當天小鼠腹部皮下注射0.2 mL誘導乳劑，同時及第48 h腹腔注射100 ng百日咳毒素；對照組在相同時間注射等容積生理鹽水。

2.2 給藥 開始免疫的當天記為免疫后第1天，Tri組免疫后第7天起每日腹腔注射Tri 100μg／（kg·d），對照組及模型組每日腹腔注射等容積的生理鹽水，均每日上午1次，連續(xù)7 d。

2.3 實驗動物處置及標本收集 動物在免疫后第14天，經(jīng)2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，4℃生理鹽水心臟灌流后快速取脊髓腰膨大，隨后4%多聚甲醛心臟灌流，于冰上斷頭取腦組織及脊髓頸膨大，將腦組織置于4%多聚甲醛，4℃冰箱過夜。第2天取出標本，依次于20%及30%蔗糖PBS緩沖液中脫水，OCT包埋，-20℃冰凍切片機從視交叉往后行連續(xù)冠狀冰凍切片，制8μm厚切片。頸膨大置于10%的福爾馬林中固定，18 h后作石蠟包埋，制4μm厚切片。

3 觀察指標

3.1 神經(jīng)功能評分 常規(guī)飼養(yǎng)3組小鼠，在免疫后第14天進行神經(jīng)功能評分，評分采用15分法［6］。尾巴：無癥狀0分；半癱1分，全癱2分。肢體（對每個肢體進行單獨評分）：無癥狀0分，肢體力弱或步態(tài)改變1分，不完全癱瘓2分，完全癱瘓3分。對尾巴和每個肢體的情況逐一評分，累加得出總分，死亡記為15分。

3.2 病理學觀察 頸膨大每只動物隨機取3張切片，行HE染色后光學顯微鏡下觀察炎性浸潤細胞情況，每張切片隨機取5個不重復的高倍視野，盲法計算炎性浸潤細胞數(shù)，把炎性浸潤細胞數(shù)相加作為該只小鼠的總的炎性浸潤細胞數(shù)。

3.3 免疫熒光檢測大腦CD80和CD206蛋白的表達 每只動物分別取3張連續(xù)的大腦冰凍切片，PBS溶液漂洗5 min×3次，10%驢血清在37℃下封閉20 min，加CD80和CD206一抗，4℃過夜，37℃復溫15 min，PBS溶液漂洗5 min×3次，避光加熒光標記二抗，37℃孵育1 h，避光漂洗，加DAPI，封片，熒光顯微鏡下觀察。每張切片隨機取5個不重復的視野拍照，盲法計算陽性細胞數(shù)。

3.4 ELISA法檢測腰膨大TGF-β1、TNF-α水平各組小鼠腰膨大于4℃冰浴下勻漿，離心，提取上清液，每孔加上清液100μL，置37℃環(huán)境120 min，隨后采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗法測定TGF-β1、TNF-α蛋白的表達。檢測方法按說明書進行。

3.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 27.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q法。

4 結 果

4.1 3組免疫后第14天神經(jīng)功能評分的比較 見表1。

4.2 3組小鼠頸膨大病理形態(tài)的比較 對照組病理未見炎性細胞浸潤。模型組及Tri組可見較多炎性細胞浸潤，部分小血管周圍有大量炎性浸潤細胞，形成“袖套”狀改變，說明造模成功。模型組炎性浸潤細胞數(shù)為（130.55±20.60）個，Tri組炎性浸潤細胞數(shù)為（109.70±26.87）個，Tri組比模型組減少（P＜0.05）。見圖1。

表1 3組免疫后第14天神經(jīng)功能評分（±s）

表1 3組免疫后第14天神經(jīng)功能評分（±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05。

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圖1 3組小鼠病理形態(tài)HE染色圖（×400）

4.3 3組小鼠大腦CD80及CD206蛋白表達的比較 免疫熒光染色顯示：免疫后第14天模型組及Tri組CD80及CD206均有大量表達，而對照組幾乎不表達CD80、CD206，見圖2～圖4。

圖2 3組小鼠大腦CD80蛋白表達的免疫熒光圖（×400）

圖3 3組小鼠大腦CD206蛋白表達的免疫熒光圖（×400）

圖4 模型組與Tri組CD80、CD206陽性細胞數(shù)比較

4.4 3組小鼠腰膨大TNF-α、TGF-β1水平比較見表2。

表2 3組小鼠腰膨大TNF-α、TGF-β1水平比較（±s）

表2 3組小鼠腰膨大TNF-α、TGF-β1水平比較（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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5 討 論

MS患者的CNS的炎癥反應誘導大量小膠質(zhì)／巨噬細胞向M1型極化，并抑制小膠質(zhì)／巨噬細胞向M2型極化，破壞M1／M2的相對平衡，外周的免疫細胞大量進入CNS，加劇CNS炎癥反應，使病情惡化，這可能是MS病情反復發(fā)作的主要機制［1-2］。如果能促進小膠質(zhì)／巨噬細胞向M2型的極化，就能對MS起到一定治療作用。

現(xiàn)代醫(yī)學研究證明雷公藤有免疫抑制、抗炎、抗腫瘤等多種作用，為多靶點免疫抑制劑，廣泛應用于風濕性關節(jié)炎、銀屑病、腎炎、濕疹等自身免疫性疾病的治療，取得良好的臨床療效，但因其副作用限制了進一步的臨床應用［7-8］。雷公藤提取物的研究是目前的熱點［7-11］。Tri是雷公藤的單體提取物，分子式已經(jīng)清楚，且目前有Tri脂質(zhì)體納米顆粒等劑型［10］，減輕了雷公藤的嚴重不良反應。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Tri對EAE的療效較好，能促進CNS炎癥浸潤細胞凋亡［4］。宋海紅等在體外實驗中發(fā)現(xiàn)Tri能抑制小膠質(zhì)細胞的炎癥反應［11］，但目前尚未見Tri對EAE小膠質(zhì)／巨噬細胞M1／M2極化影響的研究。

在本實驗中，Tri組神經(jīng)功能評分低于模型組，Tri組的頸膨大炎性浸潤細胞少于模型組，從臨床及病理證實了Tri能減輕EAE的病情。CD80是M1型小膠質(zhì)／巨噬細胞的標志物，CD206是M2型小膠質(zhì)／巨噬細胞的標志物。模型組CD80蛋白表達量高于CD206型，說明EAE是以M1極化為主；Tri組CD206細胞數(shù)量高于CD80，說明Tri能夠誘導EAE小膠質(zhì)／巨噬細胞從M1極化向M2極化轉變；Tri組CD80數(shù)量低于模型組，Tri組CD206高于模型組，說明Tri既能抑制M1型小膠質(zhì)／巨噬細胞的生成，又能促進M2型小膠質(zhì)／巨噬細胞的產(chǎn)生，從而影響了M1／M2的平衡，促進M2極化，減輕病情。促炎因子TNF-α是M1型小膠質(zhì)／巨噬細胞的下游產(chǎn)物，抗炎因子TGF-β1是M2型小膠質(zhì)／巨噬細胞的下游產(chǎn)物，Tri組與模型組TNF-α蛋白及TGFβ1蛋白含量均增高，以TNF-α增高為主，說明EAE小鼠整體炎癥反應水平上調(diào)。Tri組TNF-α蛋白表達低于模型組，TGF-β1蛋白含量高于模型組，說明Tri可能通過調(diào)控M1／M2極化，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，促進抗炎因子的表達，減輕炎癥反應，促進病情緩解。

總之，本研究提示Tri對EAE有治療作用，其機制之一可能是通過促進EAE小膠質(zhì)／巨噬細胞從M1極化向M2極化轉變，從而減輕炎癥反應，減輕EAE的病情，這為臨床應用Tri治療MS提供實驗基礎。但Tri調(diào)控EAE小膠質(zhì)／巨噬細胞M1／M2極化的動態(tài)規(guī)律及分子機制尚未明確，有待進一步研究。