裴田瑛，顏帥帥，許強華，2，3，4*

(1.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306； 2.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室，上海 201306； 3.國家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 4.遠(yuǎn)洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

微小RNA(microRNA，以下簡寫為miRNA)是內(nèi)源性的約22個核苷酸的RNA，主要通過結(jié)合靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)來抑制靶基因的翻譯或?qū)е耺RNA降解，從而抑制靶基因的表達(dá)，在動植物mRNA轉(zhuǎn)錄水平中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。近年來，已有不少關(guān)于miRNA對血細(xì)胞生成調(diào)控的研究報道，多種miRNAs是血細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在造血中起重要作用。如miR-144和miR-451在紅細(xì)胞生成中發(fā)揮重要作用，受GATA-1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)并最終影響紅細(xì)胞的生成，在GATA-1敲除的鼠細(xì)胞中，miR-144和miR-451的過表達(dá)，均未能恢復(fù)GATA-1缺失的影響[2]。miR-221和miR-222抑制正常的血紅細(xì)胞生成，在成熟過程中導(dǎo)致早期成紅細(xì)胞表達(dá)下降[3]。眾多研究表明，造血系統(tǒng)的正常生成在很大程度上依賴轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)；在血紅細(xì)胞生成過程中，轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)歷了一系列的動態(tài)變化，影響著細(xì)胞的增殖和發(fā)育成熟[4-7]。其中ALAS2(delta-aminolevulinate synthase 2)是血紅細(xì)胞生成過程中最重要的一個轉(zhuǎn)錄因子，ALAS2基因的生成是催化紅細(xì)胞中血紅素生物合成的限速步驟[8]。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，生長于高海拔的青藏高原裂腹魚與低海拔的裂腹魚相比，其血紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量均明顯下降[9]，且高海拔裂腹魚血液組織中有眾多高表達(dá)的miRNAs(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，這些高表達(dá)的miRNAs可能抑制著高海拔裂腹魚血紅細(xì)胞的生成。在高海拔裂腹魚血液組織高表達(dá)的miRNAs中，miR-30e是呈現(xiàn)顯著高表達(dá)的一個miRNA(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，推測miR-30e可能在抑制高原裂腹魚血紅細(xì)胞生成中起著重要作用。在此基礎(chǔ)上，本試驗中以斑馬魚Daniorerio為研究對象，利用顯微注射、靶基因驗證等試驗方法，研究了miR-30e在斑馬魚紅細(xì)胞生成過程中的作用機制，探索了miR-30e對紅細(xì)胞生成的調(diào)控作用，以期為了解魚類紅細(xì)胞的生成機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用野生型斑馬魚(AB型)飼養(yǎng)在實驗室封閉的水超濾超凈化系統(tǒng)中(上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司)，培養(yǎng)條件為28 ℃循環(huán)水、黑暗10 h、光照14 h，自然產(chǎn)卵后收集所有胚胎。

試驗用細(xì)胞系293T在含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、雙抗及Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、溫度37 ℃。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚miR-30e靶基因的預(yù)測 利用DIANA-dre、TargetScan、miRDB等軟件進行miR-30e的靶標(biāo)預(yù)測，根據(jù)其結(jié)果，ALAS2被預(yù)測為miR-30e的潛在靶標(biāo)。

1.2.2 構(gòu)建包含ALAS2-3′UTR的質(zhì)粒 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得斑馬魚miR-30e靶基因ALAS2的3′UTR序列。利用反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，PCR擴增得到靶基因的3′UTR，并將其連接至PmirGLO(熒光素酶報告基因)和Tol2-EGFP質(zhì)粒中。PCR反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性4 min；95 ℃下變性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進行32個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下冷卻10 min。PCR所用引物如表1所示。

表1 斑馬魚ALAS2-3′UTR克隆引物序列

1.2.3 斑馬魚胚胎血紅蛋白檢測 取性成熟的雌雄斑馬魚交配產(chǎn)生的受精卵，使用顯微注射儀將1 nL的miR-30e模擬體(UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG)(50 μm)和miRNA模擬體(UU- GUACUACACAAAAGUACUG)(50 μm，NC對照)，分別注射到斑馬魚受精卵發(fā)育的第一細(xì)胞期內(nèi)，同時以注射1 nL去離子水的胚胎作為空白對照，顯微注射48 h后對胚胎進行固藍(lán)染色，觀察其血紅蛋白含量的變化。首先，用體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛來固定注射后的斑馬魚胚胎6 h以上，隨后用1×PBS清洗表面雜質(zhì)，加入適量固藍(lán)染色液，于搖床避光染色20 min，棄去染液并清洗后，于顯微鏡下觀察統(tǒng)計血紅蛋白的區(qū)域。miR-30e模擬體和miRNA模擬體由蘇州吉馬公司合成。

1.2.4 斑馬魚胚胎GFP熒光檢測 使用顯微注射儀將1 nL的miR-30e模擬體(50 μm)和miRNA模擬體(50 μm)(NC對照)分別與100 ng的Tol2-EGFP-ALAS2-3′UTR共注射到斑馬魚受精卵的第一細(xì)胞期內(nèi)，同時以注射1 nL 100 ng的Tol2-EGFP-ALAS2-3′UTR作為空白對照，注射24 h后在熒光顯微鏡下對胚胎進行觀察并檢測熒光強度的變化。

1.2.5 雙熒光素酶活性檢測 用24孔板培養(yǎng)293T細(xì)胞，直至細(xì)胞密度達(dá)到80%，根據(jù)Attractene Transfection(QIAGEN)轉(zhuǎn)染試劑提供的說明書，將PmirGLO-ALAS2-3′UTR與miR-30e共轉(zhuǎn)染，同時增設(shè)陰性對照(PmirGLO-ALAS2-3′UTR與miRNA共轉(zhuǎn)染)和空白對照(PmirGLO-ALAS2-3′UTR單獨轉(zhuǎn)染)，每組設(shè)3個重復(fù)，轉(zhuǎn)染完成并培養(yǎng)24～48 h后，使用Dual-Luciferase試劑盒對細(xì)胞進行雙熒光素酶活性測定，并計算相對比值。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡分析 將共注射Tol2-EGFP-ALAS2-3′UTR質(zhì)粒的3組(空白對照、陰性對照和miR-30e模擬體)斑馬魚胚胎用1×PBS洗滌3次，然后用蛋白酶裂解液在冰上裂解30 min，提取蛋白質(zhì)。使用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-聚丙烯酰胺凝膠從每個樣品中分離相同量(100 μg)的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；用1×PBST溶液溶解的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶封閉，隨后在室溫下分別將膜與抗GFP和抗β-肌動蛋白孵育1 h；再用1×PBST洗滌3次，并于室溫下與上述二抗一起孵育1 h。使用增強的化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡系統(tǒng)使蛋白質(zhì)條帶可視化，以β-肌動蛋白的蛋白質(zhì)水平為內(nèi)源對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-30e靶基因的預(yù)測

對miR-30e可能作用的靶基因進行生物學(xué)信息預(yù)測，結(jié)果表明，ALAS2基因的3′UTR區(qū)域與miR-30e互補配對，ALAS2基因可能是miR-30e的一個靶基因(圖1)。此外，在人類、斑馬魚、黑猩猩、大鼠和三文魚中，miR-30e相應(yīng)的種子序列高度保守(黑線標(biāo)出部分)(表2)。

圖1 miR-30e與ALAS2作用原理Fig.1 Principle of action between miR-30e and ALAS2

表2 miR-30e在物種間的保守性Tab.2 Conversation of miR-30e among different species

2.2 過表達(dá)miR-30e對血紅蛋白的影響

固藍(lán)染色結(jié)果顯示，顯微注射miR-30e模擬體的斑馬魚胚胎體內(nèi)血紅蛋白含量明顯低于注射miRNA模擬體的陰性對照組與注射去離子水的空白對照組(圖2，箭頭所指的紅色區(qū)域)，說明miR-30e在一定程度上對血紅蛋白的表達(dá)起到抑制作用。

箭頭所指紅色區(qū)域為固藍(lán)染色后斑馬魚血紅蛋白。The arrow showing the red area indicates the zebrafish hemoglobin stained by O-dianisdine.圖2 血紅蛋白表達(dá)的固藍(lán)染色檢測Fig.2 Detection of hemoglobin expression by O-dianisdine staining

2.3 miR-30e在體外抑制ALAS2的表達(dá)

擴增長度約為500 bp的斑馬魚ALAS2-3′UTR作用位點周邊序列(圖3)，在熒光素酶報告載體PmirGLO中重組了含有ALAS2-3′UTR的質(zhì)粒。ALAS2-3′UTR位于螢火蟲熒光素酶編碼區(qū)的下游(圖1)，將重組質(zhì)粒PmirGLO-ALAS2-3′UTR與miR-30e模擬體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，與PmirGLO-ALAS2-3′UTR空白對照、miRNA+PmirGLO-ALAS2-3′UTR陰性對照細(xì)胞相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用miR-30e模擬體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性比值顯著下調(diào)(P<0.05),而陰性對照組與空白對照組無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

M—DNA2000 Marker；1—miR-30e與ALAS2-3′UTR作用位點的擴增條帶。M—DNA2000 Marker; 1—the amplification of binding site between ALAS2-3′UTR and miR-30e.圖3 斑馬魚ALAS2基因3′UTR擴增Fig.3 Amplification of the 3′UTR of the ALAS2 gene in zebrafish

*表示對照組與miR-30e試驗組存在顯著性差異(P<0.05)。* means significant difference between the control group and the miR-30e experiment group(P<0.05).圖4 雙熒光素酶活性的檢測Fig.4 Detection of dual luciferase activity

2.4 miR-30e在體內(nèi)抑制ALAS2的表達(dá)

將重組的Tol2-EGFP質(zhì)粒與miR-30e模擬體共注射第一細(xì)胞期的斑馬魚胚胎，與共注射miRNA模擬體的陰性對照組相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用miR-30e模擬體共注射的胚胎中，GFP熒光強度明顯降低(圖5)，這意味著miR-30e可以靶向作用于ALAS2。同時，提取胚胎總蛋白進行Western blot檢測，結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，共注射Tol2-EGFP質(zhì)粒與miR-30e模擬體的試驗組蛋白表達(dá)量明顯下降(圖6)。

綠色為斑馬魚胚胎注射Tol2質(zhì)粒后的熒光發(fā)光亮度。the fluorescence intensity of zebrafish embryos injected with Tol2 plasmid is shown in green color.圖5 斑馬魚胚胎的GFP熒光檢測Fig.5 Detection of GFP fluorescence in zebrafish embryos

圖6 斑馬魚胚胎的GFP蛋白檢測Fig.6 Detection of GFP protein in zebrafish embryos

這些結(jié)果表明，miR-30e通過與其在ALAS2-3′UTR處的結(jié)合位點相互作用，來抑制ALAS2的表達(dá)，同時也表明，miR-30e對ALAS2的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。

3 討論

3.1 miR-30e的作用機制

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，長期處于高海拔低氧環(huán)境下的青藏高原裂腹魚的血紅蛋白與血細(xì)胞數(shù)量比低海拔裂腹魚明顯減少[9]，且對不同海拔高度裂腹魚血液組織中的miRNA比較發(fā)現(xiàn)，miR-30e在高海拔裂腹魚血液組織中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)。本研究中以此為切入點，合成了miRNA-30e模擬體，運用顯微注射儀注射到斑馬魚胚胎第一細(xì)胞期內(nèi)，固藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，斑馬魚血紅蛋白含量明顯下降(圖2)，這說明miRNA-30e抑制了紅細(xì)胞的生成。

目前，關(guān)于miRNA對紅細(xì)胞生成的影響已有不少研究報道，迄今未見miR-30e影響血紅細(xì)胞生成的相關(guān)研究。關(guān)于miR-30e在心血管發(fā)育方面的研究也僅有零星報道。有研究已報道了miRNA-30e在動脈粥樣硬化中的作用及存在的潛在機制，即miRNA-30e的下調(diào)增加了體外氧化應(yīng)激和活性氧水平，通過轉(zhuǎn)化生長因子介導(dǎo)NADPH氧化酶4氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化[10]。miRNA-30e通過自噬和神經(jīng)源性基因座缺口同源蛋白-1/磷酸化蛋白激酶B信號傳導(dǎo)途徑保護心臟免于缺血/再灌注損傷，miR-30e還可以通過抑制細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白(Twinfilin-1)的表達(dá)來調(diào)控心肌肥厚增生[11]。還有研究顯示，miR-30e在血管發(fā)育中也發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12]。

在此之前，尚未有關(guān)于miR-30e對紅細(xì)胞生成作用的研究報道。在后續(xù)研究中，作者擬對miR-30e進行體內(nèi)敲除，更好地研究miR-30e對紅細(xì)胞生成的作用機制。

3.2 miR-30e的靶基因ALAS2

本研究中，通過分子生物學(xué)方法探究了miRNA-30e對紅細(xì)胞生成的作用，生物信息學(xué)分析表明，miR-30e靶向結(jié)合ALAS2的3′UTR，使用斑馬魚模型進行體內(nèi)驗證試驗，結(jié)合體外的細(xì)胞共轉(zhuǎn)染等試驗，一系列試驗結(jié)果表明，miRNA-30e的過表達(dá)抑制了ALAS2基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞的生成受阻，進一步證明了miRNA對紅系發(fā)育的調(diào)控作用。

眾所周知，造血是一個涉及復(fù)雜遺傳程序的發(fā)育過程，它產(chǎn)生一種稱為紅細(xì)胞的主要細(xì)胞譜系，通常發(fā)生在硬骨魚的腎髓中[13]。研究表明，紅細(xì)胞的生成受許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用是不同的[14]。其中ALAS2作為特異調(diào)節(jié)紅系發(fā)育的限速酶，在紅系祖細(xì)胞中表達(dá)并調(diào)節(jié)血紅素的生物合成[15]，其已經(jīng)被確認(rèn)為是多個miRNA的靶基因，這些miRNA通過靶向ALAS2基因來調(diào)控紅系細(xì)胞的生成。胡星星等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-7132通過靶向ALAS2參與南極冰魚紅細(xì)胞生成過程；Xu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏血紅細(xì)胞的南極冰魚高表達(dá)的miRNA中，靶基因預(yù)測顯示，共有91種miRNA靶向紅細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子，其中ALAS2可能受最大數(shù)量的miRNAs調(diào)控[17]。由此可見，ALAS2在紅系中的重要性。

4 結(jié)論

1) 本研究中利用生物信息軟件預(yù)測ALAS2是斑馬魚miR-30e的一個靶基因。

2) 本研究結(jié)合細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)、熒光素酶報告系統(tǒng)、胚胎顯微注射等試驗方法綜合驗證了miR-30e通過靶向作用于ALAS2的3′UTR序列，抑制ALAS2表達(dá)，從而參與斑馬魚紅細(xì)胞生成的過程。