趙娟,王科,楊帆(湘潭市食品藥品檢驗所,湖南 湘潭 411100)
蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北蒼術(shù)Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖,辛、苦,溫,歸脾、胃、肝經(jīng),具有燥濕徤脾、祛風散寒、明目的功效,用于濕阻中焦、脘腹脹滿、泄瀉、水腫、腳氣痿躄、風濕痹痛、風寒感冒、夜盲、眼目昏澀[1]。蒼術(shù)的炮制品從唐代開始已有記載,歷代沿用的方法有炒焦、炒黃、炒炭、米泔水炒、麩炒、土炒、醋炒、鹽炒、酒制等20 余種[2],而目前《中國藥典》2020年版一部僅收錄了生品和麩炒兩種[1]。
蒼術(shù)是常用中藥材,不同的炮制方式在臨床使用時有不同藥效[3],本文采用了麩炒、炒焦、曬干、烘干4 種常用且操作簡單的炮制方式,分別對茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)進行處理,運用HPLC 法測定蒼術(shù)素的含量,并通過特征圖譜比較炮制前后的成分變化情況,旨在為蒼術(shù)的炮制和臨床使用提供參考。
安捷倫1260高效液相色譜儀,包括VWD1260紫外檢測器(美國安捷倫公司);SHIMADZU 電子天平(AUW220D)(日本島津);高速萬能粉碎機FW100(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司);電熱鼓風干燥箱WGLL-125BE(天津市泰斯特儀器有限公司)。
蒼術(shù)素對照品(批號:111924-201605,純度:99.5%)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺?11976-201501,純度:99.9%)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品(批號:111978-201501,純度:99.9%)(中國食品藥品檢定研究院);β-桉葉醇對照品(STANDARD,批號:473-15-4,純度>98%);蒼術(shù)苷A 對照品(成都普瑞發(fā)科技開發(fā)有限公司,CAS:126054-77-1,純度:98%);北蒼術(shù)對照藥材(批號:120983-201605),茅蒼術(shù)對照藥材(批號:120932-201708)(中國食品藥品檢定研究院);色譜甲醇(批號:R4CG2H)、色譜乙腈(批號:P3RA1H)(Honeywell);磷酸(分析純,批號:20171218)(國藥集團化學試劑有限公司);甲苯(上海沃凱生物技術(shù)有限公司,批號:20180111);純化水實驗室自制。
樣品來源于當?shù)夭赏?,?jīng)本所蔡永副主任藥師鑒定為茅蒼術(shù)Atractylodes lancea(Thunb.)DC.和北蒼術(shù)Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的根莖鮮品,其中茅蒼術(shù)采自湖北英山縣,北蒼術(shù)采自河北涉縣。
參照《中國藥典》2020年版四部[4](通則)0213 炮制通則和《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》2010年版[5],麩炒和炒焦由湖南亞飛中藥飲片有限公司炮制完成,具體操作如下:曬干:將鮮品洗凈,曬干,撞去須根,再洗凈潤透,切片,曬干。
烘干:將鮮品洗凈,烘干,撞去須根,再洗凈潤透,切片,調(diào)節(jié)電熱鼓風干燥箱溫度為50℃烘烤24 h。
麩炒:將鮮品洗凈,曬干,撞去須根,再洗凈潤透,切片,按照100 kg 洗凈曬干切片的樣品加10 kg 麩皮的比例加入麩皮,炒至表面呈黃色或深黃色時,取出,篩去麩皮,放涼。
炒焦:將鮮品洗凈,曬干,撞去須根,再洗凈潤透,切片,放至鍋中不斷翻炒,至表面呈棕黑色,取出,放涼。
蒼術(shù)的水分值按照《中國藥典》2020年版四部[4](通則0832)第四法測定,結(jié)果見表1。
表1 不同炮制方法下蒼術(shù)的水分值(%)Tab 1 Water percentage in Atractylodis Rhizoma by different processing methods (%)
精密稱取蒼術(shù)素對照品10.80 mg,加甲醇制成21.60 μg·mL-1的溶液,即得。將“2.1”項下4 種炮制方法制備的蒼術(shù)粉碎,過三號篩,取約0.2 g,按照《中國藥典》2020年版一部[1]蒼術(shù)項下的含量測定方法進行檢測,結(jié)果見表2。單因素方差分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0 進行分析。
表2 不同炮制方法蒼術(shù)中蒼術(shù)素的含量(%, ±s,n =3)Tab 2 Content of atractylodin in Atractylodis Rhizoma by different processing methods (%, ±s,n =3)
表2 不同炮制方法蒼術(shù)中蒼術(shù)素的含量(%, ±s,n =3)Tab 2 Content of atractylodin in Atractylodis Rhizoma by different processing methods (%, ±s,n =3)
注:不同字母代表差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。Note:Different letters represent significant differences(P<0.05).
炮制方法 茅蒼術(shù)蒼術(shù)素含量 北蒼術(shù)蒼術(shù)素含量曬干烘干麩炒炒焦0.438±0.07a 0.416±0.01b 0.348±0.06c 0.273±0.03d 0.503±0.03a 0.528±0.05a 0.362±0.06b 0.287±0.05c
茅蒼術(shù)與北蒼術(shù)經(jīng)過不同方法炮制后,蒼術(shù)素的含量為:曬干法>烘干法>麩炒法>炒焦法,且不同方法之間蒼術(shù)素的含量有顯著差異,但均高于藥典標準(蒼術(shù)藥材及凈制飲片按干燥品計,蒼術(shù)素含量不得少于0.30%;麩炒蒼術(shù)則不得少于0.20%)。
2.4.1 對照品溶液的配制 精密稱取蒼術(shù)素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、β-桉葉醇、蒼術(shù)苷A 對照品適量,分別置棕色量瓶中,用甲醇溶解并定容到刻度,配制成含蒼術(shù)素0.0216 mg·mL-1,白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ0.3026 mg·mL-1,白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ0.4265 mg·mL-1,β-桉葉醇0.2282 mg·mL-1,蒼術(shù)苷A 0.4955 mg·mL-1的對照品溶液,裝入棕色液相進樣小瓶備用。
2.4.2 供試品溶液的制備 試驗避光操作。分別精密稱定不同炮制方法下的茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)粉末各約1.00 g(過三號篩),置150 mL 具塞錐形瓶中,精密加入50 mL 甲醇,稱取重量,超聲提取40 min(功率250 W,頻率40 kHz),取出放置冷卻至室溫,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液即為供試品溶液。裝入棕色液相進樣小瓶備用。
2.4.3 色譜條件 色譜柱為Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈(A),0.5%磷酸溶液(B),梯度洗脫,洗脫程序見表3[6];柱溫為30 ℃;流速為1 mL·min-1;檢測波長為220 nm;進樣量為20 μL。
表3 流動相梯度洗脫程序Tab 3 Gradient elution program
2.5.1 精密度試驗 取同一批北蒼術(shù),按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次,記錄色譜圖,以蒼術(shù)素為參照,共有峰相對保留時間RSD<1.0%,相對峰面積RSD<1.6%,結(jié)果表明儀器精密度良好。
2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批北蒼術(shù),按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.3”項下色譜條件分別在0、6、12、24 h 和1 周后進樣分析,記錄色譜圖,以蒼術(shù)素為參照,共有峰相對保留時間RSD<1.0%,相對峰面積RSD<1.9%。結(jié)果表明樣品在1 周內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.5.3 重復(fù)性試驗 取同一批北蒼術(shù)6 份,按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.3”項下色譜條件進樣分析,記錄色譜圖,以蒼術(shù)素為參照,共有峰相對保留時間RSD<1.3%,相對峰面積RSD<1.7%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。
取“2.4.1”項下對照品溶液,按照“2.4.3”項下色譜條件進樣分析,色譜圖見圖1。
圖1 各對照品HPLC 圖譜Fig 1 HPLC chromatogram of the controls
取茅蒼術(shù)對照藥材和北蒼術(shù)對照藥材各約1.00 g,按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.3”項下色譜條件進樣分析,記錄色譜圖,結(jié)果如圖2所示。
取茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)藥材各約1.00 g,按“2.4.2”項下方法制備供試溶液,按“2.4.3”項下色譜條件進樣分析,記錄色譜圖,結(jié)果見圖3及圖4。
如圖3所示,茅蒼術(shù)在不同炮制方法下特征圖譜的主要區(qū)別在與1號峰和2號峰,麩炒和炒焦后,1 號峰和2 號峰不明顯。如圖4所示,北蒼術(shù)的炒焦和麩炒品在3 號峰到6 號峰之間比曬干品有更豐富的色譜峰。結(jié)合圖2~4 來看,茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)的比較:茅蒼術(shù)7 號峰比北蒼術(shù)含量高,茅蒼術(shù)9號峰和10 號峰的比值>1,而北蒼術(shù)9 號峰和10號峰的比值<1,但從茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)的對照藥材來看并無這一特點,這可能還與樣品的產(chǎn)地有關(guān)。
圖2 茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)對照藥材特征圖譜比較Fig 2 Characteristic chromatogram of Atractylodes lancea(Thunb.)DC and Atractylodes chinensis(DC.)koicz.
圖3 不同炮制方法下茅蒼術(shù)的特征圖譜Fig 3 Characteristic chromatogram of Atractylodes lancea(Thunb.)DC with different processing methods
圖4 不同炮制方法下北蒼術(shù)的特征圖譜Fig 4 Characteristic chromatogram of Atractylodes chinensis(DC.)koicz.with different processing methods
考察了超聲提取、回流提取(1 h)和索氏提?。? h)3 種方法,結(jié)果超聲提取效率較高,操作方便快捷??疾炝瞬煌晻r間(30、40、50、60 min)(功率250 W,頻率40 kHz)提取的效果,以蒼術(shù)素的含量為依據(jù),《中國藥典》2020年版一部標準規(guī)定為超聲1 h,本文對比不同超聲時間的蒼術(shù)素色譜峰面積,結(jié)果40、50、60 min 蒼術(shù)素的峰面積之間不存在顯著性差異,所以最終確定超聲提取40 min??疾炝瞬煌瑵舛鹊募状甲鳛樘崛∫?,以蒼術(shù)素為參照物,最終確定無水甲醇提取率高。
考察了甲醇-0.5%磷酸水、乙腈-0.5%磷酸水作為流動相,使用乙腈-0.5%磷酸水作為流動相時,各峰分離度較好,基線較平穩(wěn),色譜峰信息較豐富;對比了波長220、245、254、270、340 nm 條件下色譜峰的出峰情況,在波長220 nm 下,色譜峰信息豐富,基線較平穩(wěn)[6]。
不同的炮制方法對蒼術(shù)中的蒼術(shù)素的含量具有顯著影響,且含量高低呈現(xiàn)曬干法>烘干法>麩炒法>炒焦法,但蒼術(shù)中的成分復(fù)雜,已知成分達100 多種,其質(zhì)量控制需結(jié)合臨床藥效綜合評價[7]。
傳統(tǒng)炮制理論認為蒼術(shù)炮制后可去油以減緩燥性,減少不良作用,并增強健脾止瀉作用。現(xiàn)代研究也認為蒼術(shù)中過量的揮發(fā)油對人體有較強的中樞抑制作用,且能致瀉。因此適當降低蒼術(shù)炮制品中揮發(fā)油的含量是避免其臨床毒副作用的主要方法[8]。不同炮制方法下的茅蒼術(shù)和北蒼術(shù),各峰含量不同,有學者指出炒制品尤其是麩炒品揮發(fā)油蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素相對百分含量比生品低,而茅蒼術(shù)醇和β-桉葉醇相對百分含量高,本研究炮制品蒼術(shù)素的含量低于生品,從特征圖譜上也可以看出5 號峰β-桉葉醇在茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)的炮制品中含量高于生品,目前因10 ~40 min 各峰的具體化學成分不能完全確認,有待進一步研究。
中藥炮制是指以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo),根據(jù)辨證施治用藥的需求和調(diào)劑、制劑、貯藏的不同要求,對中藥材加工處理的技術(shù)和工藝的總稱[9],其主要目的是增效減毒,更加適合臨床應(yīng)用[10]。蒼術(shù)的炮制方法沿用至今,對其炮制目的《中藥炮制經(jīng)驗集成》有“泔制、土制、麩制,去油、減緩其燥性;炒焦、能溫脾祛濕,止瀉”[11]之論述。蒼術(shù)歷代流傳下來的炮制方法多達數(shù)十種,而目前《中國藥典》2020年版僅收載生品和麩炒品,有學者認為米泔水浸炒使蒼術(shù)揮發(fā)油含量減少較多,且其炮制方法條件較難掌握,需時也較長[12],在滿足現(xiàn)代臨床需求的前提下,目前蒼術(shù)飲片實際上多使用生片、清炒(炒焦)和麩炒三種炮制品。炮制之后的蒼術(shù)各成分含量有新的變化,從中藥檢驗的角度出發(fā),利用質(zhì)譜探明蒼術(shù)各成分及其炮制前后的變化情況,是后續(xù)研究的內(nèi)容,也有利于臨床更好地使用蒼術(shù)。