曹玉娟，黃杰，黃俊杰，劉明江，李金貴*

(1. 通州灣示范區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村工作辦公室，江蘇 南通 226331；2. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

由柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)引起的雞的盲腸球蟲病，其造成的危害在雞的常見7種艾美耳球蟲中是最嚴(yán)重的[1]。柔嫩艾美耳球蟲感染的嚴(yán)重程度取決于一次攝入的卵囊量，蟲體寄生于雞盲腸上皮細(xì)胞內(nèi)，可引起雞腹瀉、血便、生長遲緩、飼料轉(zhuǎn)化率降低等臨床表現(xiàn)。多數(shù)情況下，盲腸球蟲病往往呈現(xiàn)暴發(fā)性急性經(jīng)過，數(shù)天之內(nèi)死亡率可達(dá)30%～50%，甚至更高，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，使用抗球蟲藥是防治球蟲病的常用手段之一。然而，藥物的長期使用會(huì)導(dǎo)致球蟲產(chǎn)生耐藥性并引起雞肉等產(chǎn)品中藥物殘留，進(jìn)而影響公共健康和食品安全[3]。多年來的實(shí)踐證明，中藥相對化學(xué)藥物有諸多優(yōu)點(diǎn)：如毒副作用小、價(jià)格低廉、不易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等，有望為藥物防治雞球蟲病開辟一條新的途徑[4]。本研究以柔嫩艾美耳球蟲感染肉仔雞為球蟲病模型，以檳榔、青蒿、赤石脂、白術(shù)等5味中藥進(jìn)行組方，分別以湯劑飲水和散劑拌料開展該處方防治球蟲的效果研究，結(jié)果表明中藥預(yù)防組取得了較好的療效，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要藥物

地克珠利溶液，天津市保靈動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20181003；青蒿檳榔復(fù)方由檳榔2份、青蒿1份、白術(shù)1份、黃連1份、赤石脂1份按重量配比而成，中藥飲片均購自北京時(shí)珍堂藥業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)蟲體

90只1日齡黃羽肉雞購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，飼養(yǎng)雞舍經(jīng)氨水噴灑及甲醛熏蒸消毒，確保試驗(yàn)環(huán)境無球蟲等影響因素。采用40 W燈泡照明，自由飲水?dāng)z食，用不含抗球蟲藥的全價(jià)雛雞料飼養(yǎng)至13日齡供試驗(yàn)使用。

球蟲卵囊分離自南通某養(yǎng)殖場自然發(fā)病雞盲腸，且發(fā)病雞小腸無明顯病變，綜合判定其為柔嫩艾美耳球蟲卵囊。按黃兵等[5]所述，對該分離株進(jìn)行籠飼試驗(yàn)，計(jì)算該蟲株在地克珠利作用下的病變計(jì)分減少率(RLS)、相對卵囊產(chǎn)量(ROP)、最適抗球蟲活性百分率(POAA)、抗球蟲指數(shù)(ACI)，結(jié)果顯示4項(xiàng)指標(biāo)均呈現(xiàn)耐藥，表明該分離株對地克珠利重度耐藥。

1.3 試驗(yàn)分組和設(shè)計(jì)

13日齡時(shí)對試驗(yàn)雞進(jìn)行稱重，篩選體重在95 g以上的雞70只隨機(jī)分為7組，每組10只，即：空白對照組、感染對照組、地克珠利預(yù)防組、中藥散劑預(yù)防組、中藥散劑治療組、中藥湯劑預(yù)防組和中藥湯劑治療組。除空白對照組外，雛雞飼養(yǎng)至14日齡時(shí)，每只雞灌服6×104個(gè)孢子化卵囊，其中預(yù)防給藥組于13日齡給藥，連續(xù)給藥4 d；治療組于灌服卵囊后72 h后開始給藥，連續(xù)給藥4 d。中藥散劑采用打粉后以10%拌料給藥，湯劑則用等量藥物進(jìn)行煎煮后飲水給藥。

1.4 卵囊計(jì)數(shù)及計(jì)算卵囊值

接種后120 h開始每24 h收集各組糞便，將每組糞便樣品攪勻后取1 g，加10 mL去離子水懸浮，用麥克馬斯特計(jì)數(shù)法進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，每組重復(fù)3次，計(jì)算平均值，連續(xù)收集4 d，4 d的卵囊數(shù)總和記作該組每克糞便中的卵囊數(shù)，即OPG[6]。卵囊數(shù)(×106)范圍在0～0.1、0.1～1.0、1.1～1.9、2.0～5.9、6.0～10.9以及大于11所對應(yīng)的卵囊值(oocyst index, OI)分別為0、1、10、20、30和40。

1.5 試驗(yàn)雞增重、存活率以及藥物抗球蟲指數(shù)分析

試驗(yàn)過程中記錄雞的死亡情況，感染后192 h對每組雞進(jìn)行空腹稱重，剖殺暴露盲腸，按文獻(xiàn)[7]的方法評(píng)定盲腸病變記分，將病變記分×10作為病變值，并結(jié)合卵囊值、相對增重率和存活率計(jì)算抗球蟲指數(shù)(ACI)。

相對增重率%=各組雞的平均增重/健康對照組雞的平均增重×100；

存活率%=組內(nèi)存活只數(shù)/組內(nèi)參試雞總數(shù)×100；

ACI=(相對增重率+存活率)-(病變值+卵囊值)。

1.6 盲腸病變及掃描電鏡觀察

盲腸病變記分后采集盲腸中段，用PBS溶液沖洗干凈后放入2.5%戊二醛固定液4 ℃固定2 h以上；PBS漂洗3次；梯度乙醇(30%、40%、50%、70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ)脫水各15 min；先后經(jīng)體積比1∶1的乙酸異戊酯無水乙醇和乙酸異戊酯處理各30 min以除去乙醇；在 CO2臨界點(diǎn)干燥后進(jìn)行LeicaSCD500刻蝕鍍膜儀噴金處理；最后XL-30 ESEM環(huán)境掃描電鏡觀察[8]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，運(yùn)行Graphpad prism 6.01軟件運(yùn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05作為組間差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 體重變化

由表1可以看出感染對照組增重最少，相對增重率最低，只有53.96%；地克珠利預(yù)防組相對增重率略高于感染對照組，達(dá)到66.28%；中藥散劑治療組的相對增重率達(dá)到74.68%，與中藥湯劑治療組的效果相接近，相對于感染對照組有較大提升。增重效果最好的是中藥散劑預(yù)防組，該組雞體重相對增重率最高，達(dá)到了93.81%，而中藥湯劑預(yù)防組則達(dá)到了86.55%。這說明中藥復(fù)方對于雞球蟲病的預(yù)防效果好于治療效果。

表1 中藥復(fù)方以及地克珠利對雞增重的影響

2.2 卵囊數(shù)檢測

球蟲感染對照組的卵囊數(shù)從第6天開始增加，到第8天時(shí)(192 h)明顯增多，OPG可達(dá)到8×106個(gè)；地克珠利預(yù)防組卵囊數(shù)變化趨勢與感染對照組相同，其OPG僅次于感染對照組，近7×106個(gè)；中藥散劑預(yù)防組和湯劑預(yù)防組的OPG變化趨勢接近，相較于感染對照組大幅下降，是所有組中OPG最低的2組；中藥散劑治療組的OPG為5×106個(gè)，而湯劑治療組的為3×106個(gè)。這說明使用中藥預(yù)防明顯減少了卵囊的生成，并與相對增重的結(jié)果吻合?？瞻捉M、感染對照組、地克珠利預(yù)防給藥組、中藥散劑治療組、中藥散劑預(yù)防組、中藥湯劑治療組和中藥湯劑預(yù)防組所對應(yīng)的卵囊值分別為0、30、30、20、10、20和10。

2.3 腸道病變

感染球蟲120 h后，感染對照組、地克珠利預(yù)防組、中藥散劑治療組和湯劑治療組均出現(xiàn)血便，2個(gè)預(yù)防用藥組則未見血便。雞剖殺后分離盲腸，可發(fā)現(xiàn)空白組雞的盲腸無外觀病變；感染對照組病變明顯，盲腸變短但腫大，外觀漿膜面呈深紅色，且有明顯盲腸芯；地克珠利預(yù)防組的盲腸也變短，并有盲腸芯存在，腫大程度較感染對照組略輕；2個(gè)中藥治療組的盲腸也明顯變短，但無盲腸芯；中藥散劑預(yù)防組的盲腸外觀接近空白對照組。各組盲腸外觀病變見圖1。

圖1 各組雞盲腸病變情況

2.4 抗球蟲指數(shù)

從存活率來看，感染對照組、地克珠利預(yù)防組和中藥散劑治療組都存在試驗(yàn)雞死亡，存活率為90%。中藥散劑預(yù)防組和湯劑預(yù)防組的ACI分別達(dá)到176.76和165.12，說明預(yù)防給藥的抗球蟲效果均達(dá)到良好水平；而感染3 d后用藥的中藥散劑治療組和湯劑治療組的ACI分別為126.35和132.88，但相對于感染對照組也有改善，而地克珠利預(yù)防組幾乎無治療效果。具體結(jié)果見表2。

2.5 掃描電鏡

如圖2所示，空白組的腸道光滑平整，無卵囊和球蟲寄生，腸道微絨毛無損傷；感染對照組的腸道上有較多卵囊存在，微絨毛破壞嚴(yán)重；地克珠利預(yù)防組的腸道損傷也比較嚴(yán)重，存在較多卵囊，腸道微絨毛減少、萎縮；中藥散劑和湯劑治療組以及對應(yīng)的預(yù)防組腸道組織都可以發(fā)現(xiàn)少量球蟲卵囊，相較感染對照組與地克珠利組明顯減少。4個(gè)中藥組的腸道損傷明顯減輕，微絨毛等結(jié)構(gòu)相對完整。

表2 中藥復(fù)方抗盲腸球蟲病效果評(píng)價(jià)

圖2 各組盲腸組織掃描電鏡觀察(紅色箭頭為球蟲卵囊)

3 討論

本試驗(yàn)使用了地克珠利耐藥株進(jìn)行的感染結(jié)果顯示該中藥復(fù)方預(yù)防給藥對球蟲感染具有很好的抑制感染作用，其ACI達(dá)到160以上的良好水平；治療用藥也有一定的效果，但效果較差；而地克珠利幾乎無效，較好地說明了對于耐藥蟲株，使用中藥預(yù)防用藥有望實(shí)現(xiàn)對盲腸球蟲病的有效控制。該中藥復(fù)方由青蒿、檳榔、白術(shù)、赤石脂等組成。按傳統(tǒng)功效青蒿具有截瘧作用，檳榔則具有行氣破滯、促消化功能，白術(shù)可健脾燥濕，而赤石脂則能夠收斂止血止瀉，故幾個(gè)藥物聯(lián)合使用較好地達(dá)到了預(yù)防球蟲感染作用。

近年來以青蒿組成中藥復(fù)方開展的抗球蟲研究較多，如青蒿、鷹爪風(fēng)、山茶根、黃柏等組成的中藥復(fù)方可以增加球蟲病雞的存活率[9]；河南黑馬動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的青蒿散能緩解柔嫩艾美耳球蟲感染所致的盲腸組織病變，減少糞便中卵囊的排出量，并呈現(xiàn)劑量依賴性，混飼高劑量(500 mg/kg)青蒿散組的ACI達(dá)到137[10]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)青蒿中的青蒿素是非常有效的瘧原蟲抑殺劑，雞球蟲和瘧原蟲同屬頂復(fù)器門原蟲，兩者有相似的繁殖特性。故推測青蒿素對球蟲病也有抑制作用，試驗(yàn)證明單用青蒿素對雞球蟲病防治確有一定效果，青蒿素對球蟲的第二代裂殖子微線基因有顯著的抑制作用，促進(jìn)第二代裂殖子凋亡，從而減少卵囊的產(chǎn)生，并可抑制球蟲感染引起的炎癥反應(yīng)[11]，這應(yīng)該是本方能夠發(fā)揮抗球蟲療效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。青蒿內(nèi)除了青蒿素外，可能還含有其他具有抗球蟲功效的物質(zhì)，這是因?yàn)榍噍锔稍锶~片的抗球蟲效果好于純青蒿素給藥組[12]。目前已知青蒿素不耐高溫且不溶于水[13]，但與組方內(nèi)其他藥物混合煎煮時(shí)可能有助于有效成分的溶出，但青蒿素卻易被煎煮溫度破壞，這可能是拌料給藥的效果略好于湯劑飲水效果的原因。

此外，該組方中的檳榔也具有較好的抗球蟲感染作用，試驗(yàn)表明在雛雞日齡中混飼給予600 mg/kg檳榔提取物預(yù)防柔嫩艾美耳球蟲耐藥株引起的球蟲病的ACI可達(dá)到140[14]。在本試驗(yàn)中，將青蒿、檳榔聯(lián)合使用，并配合健脾燥濕止瀉的藥物，使ACI達(dá)到了170以上，體現(xiàn)了配方藥物之間具有良好的協(xié)同作用，并對地克珠利耐藥株起到了良好的預(yù)防感染作用。下一步可對此復(fù)方進(jìn)行拆方對比研究，進(jìn)一步優(yōu)化該處方并逐步明確發(fā)揮藥效的關(guān)鍵物質(zhì)，對中藥抗球蟲新藥的開發(fā)具有重要意義。