王林，吳迪，高曉龍，張瑋，張啟龍，栗云鵬，韋海濤，周德剛，劉曉冬，宋彥軍

(北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的豬以呼吸障礙、神經(jīng)癥狀和全身出血為主要特征的急性、熱性、高度傳染性疫病。家豬感染后的臨床表現(xiàn)為高熱、嘔吐、腹瀉或便秘，最明顯的剖檢癥狀為脾臟腫大，致死率可高達(dá)100%[1]。1921年在肯尼亞首次記載了非洲豬瘟的暴發(fā)，之后該病主要流行于非洲各國(guó)，并相繼傳入西歐、南美和東歐等多個(gè)國(guó)家，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)危害[2]。具有診斷學(xué)意義的病毒基因主要有B646L，大小為1 938 bp，編碼結(jié)構(gòu)蛋白P72(VP73)，位于中心保守區(qū)[3]。在不同毒株間核苷酸同源性達(dá)95.5%～100%，氨基酸同源性達(dá)97.8%～100%[4]。B646L是公認(rèn)的分子檢測(cè)技術(shù)引物設(shè)計(jì)的理想靶標(biāo)。2018年8月3日遼寧省沈陽(yáng)市首次暴發(fā)非洲豬瘟疫情，10個(gè)月內(nèi)席卷全國(guó)31省市，累計(jì)報(bào)告疫情152起，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[5]。目前尚無(wú)有效疫苗進(jìn)行防控，因此在臨床上需要一種能夠快速檢測(cè)或篩查ASFV毒株的檢測(cè)方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法是由日本學(xué)者Notomi在2000年發(fā)明的一種適用于基因診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[6]，該方法利用設(shè)計(jì)的4條特異性引物和具有鏈置換特性的BstDNA聚合酶，在30～60 min內(nèi)對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增[7]，是一種簡(jiǎn)便、快速、精確、廉價(jià)的基因擴(kuò)增方法[8]。LAMP方法適合現(xiàn)場(chǎng)、基層快速檢測(cè)，本研究建立的基于鈣黃綠素可視化LAMP檢測(cè)ASFV的方法，經(jīng)過(guò)一系列優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)特異性、靈敏性、應(yīng)用儀器設(shè)備與臨床樣品檢測(cè)進(jìn)行摸索，建立了一種ASFV LAMP目視法檢測(cè)方法，以期應(yīng)用于ASFV現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。

1 材料與方法

1.1 樣品及陽(yáng)性質(zhì)粒來(lái)源

ASF陽(yáng)性樣本(滅活)、豬細(xì)小病毒(PPV)核酸、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)核酸、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、ASF陰性樣本核酸由北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存。ASFV P72基因的重組質(zhì)粒、pUC57空載體由賽默飛世爾科技有限公司合成。

1.2 主要試劑

脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：94001)、熒光目視檢測(cè)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：94001)購(gòu)自榮研生物科技(中國(guó))有限公司。非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：040221901)購(gòu)自青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：6110A)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；無(wú)核酸酶水購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；豬瘟病毒(CSFV)活疫苗C株購(gòu)自廣東永順生物制藥股份有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)R98株、豬偽狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株購(gòu)自瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已發(fā)表的非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因(登錄號(hào):MH910495.1)，通過(guò)對(duì)GenBank里的60條非洲豬瘟P72基因的序列比對(duì)分析，找出一段相對(duì)保守的基因序列，運(yùn)用在線(xiàn)生物軟件(http://primerexplorer.jp/)，通過(guò)調(diào)整溶解溫度(Tm)值、鳥(niǎo)嘌呤(G)與胞嘧啶(C)所占比例、吉布斯自由能(dG)臨界值和擴(kuò)增長(zhǎng)度等參數(shù)值，設(shè)計(jì)2組適用于LAMP的特異性外引物組(表1)，包括基礎(chǔ)引物(F3、B3、FIP、BIP)和環(huán)引物(LB)。引物由賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司合成。

表1 引物組序列

1.4 ASFV質(zhì)粒合成與核酸提取

ASFV P72基因重組質(zhì)粒pUC57-p72、pUC57空載體，由賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司合成。對(duì)CSFV活疫苗C株、PRRSV(R98株)，PRVBartha-K61株利用全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行核酸提取，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的CSFV活疫苗C株、PRRSV(R98株)核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 陰、陽(yáng)性對(duì)照的制備

合成ASFV P72基因重組質(zhì)粒pUC57-p72，含目的片段336 bp，稀釋到103copies/μL,即為陽(yáng)性對(duì)照。將pUC57空載體質(zhì)粒和無(wú)核酸酶水，按照1∶9的比例進(jìn)行配制，混勻，終濃度為103copies/μL，即為陰性對(duì)照。

1.6 LAMP反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

為獲得較為理想的反應(yīng)體系，提高反應(yīng)的靈敏性，分別對(duì)引物濃度和反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，篩選出最佳的引物濃度和反應(yīng)溫度。以ASFV質(zhì)粒(10 ng/μL)為模板，引物濃度按照試劑盒推薦濃度進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)溫度分別設(shè)置61、63、65和67 ℃ 4個(gè)溫度進(jìn)行篩選。

1.7 特異性試驗(yàn)

以提取的ASFV陽(yáng)性樣品核酸、PRV、CSFV、PRRSV、PPV、PCV2、PEDV、豬健康組織核酸為模板進(jìn)行LAMP特異性檢測(cè)，評(píng)價(jià)建立的可視化LAMP檢測(cè)方法的特異性。

1.8 靈敏度試驗(yàn)

將合成的ASFV質(zhì)粒經(jīng)微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定，濃度為10 ng/μL，按公式：copies/μL= (6.02×1023copies/mol×10 ng/μL×10-9)/(DNA長(zhǎng)度×660 g/mol) 計(jì)算ASFV質(zhì)粒的拷貝數(shù)為3×105copies/μL，將質(zhì)粒濃度稀釋到103copies/μL，按1∶10倍比稀釋?zhuān)M(jìn)行LAMP可視化檢測(cè)方法的靈敏度研究。同時(shí)，采用ASFV熒光PCR檢測(cè)試劑盒(青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心)進(jìn)行靈敏度檢測(cè)比對(duì)，當(dāng)被檢樣品循環(huán)數(shù)值(Ct值)<40且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)，判為陽(yáng)性；當(dāng)無(wú)Ct值或Ct值≥40，判為陰性。

1.9 不同恒溫設(shè)備對(duì)LAMP檢測(cè)結(jié)果的影響

將濃度為102copies/μL的ASFV質(zhì)粒，按1∶10倍比稀釋?zhuān)♂尩?0-3copies/μL。分別在PCR儀器、恒溫水浴鍋2種不同設(shè)備進(jìn)行LAMP可視化檢測(cè)反應(yīng)，設(shè)置反應(yīng)條件均為63 ℃ 50 min，比較不同恒溫設(shè)備對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。

1.10 陽(yáng)性樣品判讀時(shí)間的確定

將ASFV質(zhì)粒在103～10-2copies/μL梯度范圍內(nèi)進(jìn)行10倍倍比稀釋后作為模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)，確定最低檢測(cè)限濃度范圍，將95%檢出率模板濃度定為最低檢出限，由此確定檢測(cè)方法陽(yáng)性結(jié)果判讀時(shí)間。

1.11 臨床樣品檢測(cè)

用已建立的可視化LAMP檢測(cè)方法與ASFV熒光PCR檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)由本實(shí)驗(yàn)室保存的300份已知陰性和陽(yáng)性的臨床樣品核酸(其中292份為陰性樣品，8份為陽(yáng)性樣品)，比對(duì)2種檢測(cè)方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 引物組合的篩選

對(duì)設(shè)計(jì)出的2組引物，利用ASFV陽(yáng)性樣品核酸為模板，進(jìn)行LAMP濁度儀檢測(cè)。引物組1在28 min檢出ASFV陽(yáng)性樣本核酸，PPV、PCV2、PEDV、CSFV、PRRSV、PRV在120 min內(nèi)均未檢出(見(jiàn)圖1)。引物組2在70 min檢出ASFV陽(yáng)性樣本核酸，PPV、PCV2、PEDV、CSFV、PRRSV、PRV在120 min內(nèi)均未檢出(見(jiàn)圖2)。分別使用ASFV質(zhì)粒(10 ng/μL)與ASFV陽(yáng)性樣本核酸對(duì)引物組1進(jìn)行擴(kuò)增效果驗(yàn)證，濁度儀擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果顯示(見(jiàn)圖3)，ASFV質(zhì)粒與陽(yáng)性樣本核酸均在50 min內(nèi)檢出，陰性對(duì)照在120 min內(nèi)未檢出。結(jié)果表明，引物1組合具有較高的擴(kuò)增效率和特異性。

1. ASFV陽(yáng)性樣品；2. PPV；3. PCV2；4. PEDV；5. CSFV；6. PRRSV；7. PRV

1. ASFV陽(yáng)性樣品；2. PPV；3. PCV2；4. PEDV；5.CSFV；6. PRRSV；7. PRV

1. ASFV病毒質(zhì)粒；2. ASFV陽(yáng)性樣品；3. 陰性對(duì)照

2.2 LAMP反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

經(jīng)過(guò)一系列LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化，得到最優(yōu)反應(yīng)體系為：2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL，8 μmol/L的外引物F3 1 μL，8 μmol/L的外引物B3 1 μL，35 μmol/L的內(nèi)引物FIP 1 μL，35 μmol/L的內(nèi)引物BIP 1 μL，15 μmol/L的環(huán)引物L(fēng)B 1 μL，無(wú)DNA酶的蒸餾水0.5 μL，酶溶液1 μL，熒光目視檢測(cè)試劑1 μL，模板5 μL。61、63、65和67 ℃出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)的時(shí)間分別為30、24、27和28 min(見(jiàn)圖4)，最佳反應(yīng)溫度為63 ℃。

A.61 ℃；B.63 ℃；C.65 ℃；D.67 ℃

2.3 靈敏度試驗(yàn)

將ASFV質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)瑵舛确秶?03～10-2copies/μL。對(duì)本研究建立的LAMP可視化快速檢測(cè)方法與非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行靈敏度檢測(cè)比對(duì)。結(jié)果顯示，本研究建立的ASFV可視化LAMP檢測(cè)方法與非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒均可以檢出到10 copies/μL。詳見(jiàn)圖5、圖6。

2.4 特異性試驗(yàn)

采用建立好的LAMP可視化檢測(cè)方法對(duì)ASFV、PRV、CSFV、PRRSV、PPV、PCV2、PEDV、豬健康組織核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，只有ASFV核酸的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其他均為陰性(見(jiàn)圖7)。

1～6. 質(zhì)粒稀釋濃度為103 ～10-2 copies/μL；7～8. 陰性對(duì)照

1～6. 質(zhì)粒稀釋濃度為103 ～10-2 copies/μL；7. 陰性對(duì)照；8. 陽(yáng)性對(duì)照

1：ASFV病毒；2：PRV；3：CSFV；4：PRRSV；5：PPV；6：PCV2；7：PEDV；8：豬健康組織

2.5 不同設(shè)備對(duì)LAMP檢測(cè)結(jié)果的影響

將ASFV質(zhì)粒(102～10-3copies/μL)分別在PCR儀器、恒溫水浴2種設(shè)備進(jìn)行LAMP可視化檢測(cè)，設(shè)置反應(yīng)溫度63 ℃，反應(yīng)時(shí)間50 min，結(jié)果顯示，使用PCR儀器與恒溫水浴設(shè)備可同時(shí)檢測(cè)到10 copies/μL(見(jiàn)圖8和圖9)。

1～6. 質(zhì)粒稀釋濃度為102 ～10-3 copies/μL；7～8. 陰性對(duì)照

1～6. 質(zhì)粒稀釋濃度102～10-3 copies/μL；7～8. 陰性對(duì)照

2.6 陽(yáng)性樣品判讀時(shí)間的確定

將ASFV質(zhì)粒在103～10-2copies/μL梯度范圍內(nèi)進(jìn)行10倍倍比稀釋后作為模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)，得出低于1 copies/μL無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)，高于102copies/μL檢出率為100%，因此確定102～1 copies/μL為最低檢測(cè)限濃度范圍，將102、10 和1 copies/μL 3個(gè)濃度分別做20次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果顯示(表2)，102copies/μL模板檢出率為100%，10 copies/μL模板檢出率為95%，1 copies/μL模板檢出率為50%。因此，確定最低檢出限為10 copies/μL濃度，擴(kuò)增曲線(xiàn)時(shí)間范圍在40～48 min，設(shè)定檢測(cè)樣品在50 min內(nèi)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)為陽(yáng)性。

2.7 LAMP可視化臨床檢測(cè)試驗(yàn)

用已建立的LAMP可視化檢測(cè)方法與ASFV熒光PCR檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)300份臨床樣品核酸(292份為陰性，8份為陽(yáng)性)。比對(duì)2種檢測(cè)方法的符合率，結(jié)果建立的LAMP方法與熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為100%。

表2 陽(yáng)性樣品判讀時(shí)間的確定 min

3 討論

目前，全世界尚無(wú)有效的非洲豬瘟疫苗進(jìn)行預(yù)防。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求豬場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、飼料廠與跨省調(diào)運(yùn)、流通環(huán)節(jié)必須進(jìn)行非洲豬瘟病毒檢測(cè)。ASFV診斷主要分為分子生物學(xué)檢測(cè)與免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)兩類(lèi)。由于免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)特異性與敏感性較低，因此，分子診斷得到了迅速發(fā)展。分子診斷技術(shù)主要包括PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、LAMP檢測(cè)技術(shù)[9]。LAMP檢測(cè)技術(shù)針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)的特殊引物與BstDNA聚合酶，可以在短時(shí)間內(nèi)高效的擴(kuò)增靶基因，并可通過(guò)熒光染色、電泳、鈣黃綠素可視化等方法進(jìn)行結(jié)果觀察[10]。2011年楊吉飛等[11]建立了ASFV LAMP檢測(cè)方法，在65 ℃水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)，利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判讀，結(jié)果顯示有嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，影響結(jié)果判讀且極易增加氣溶膠污染，氣溶膠在微生物實(shí)驗(yàn)室中很難消除。為避免這一現(xiàn)象，本研究嚴(yán)格在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行操作，開(kāi)啟機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)，在生物安全柜中進(jìn)行反應(yīng)體系的配置及模板的加入，通過(guò)在反應(yīng)體系中加入鈣黃綠素?zé)晒馊玖?，?shí)現(xiàn)了LAMP反應(yīng)管無(wú)需開(kāi)蓋便可讀取試驗(yàn)結(jié)果，方便安全[12]。

與熒光定量PCR檢測(cè)方法相比，LAMP檢測(cè)方法更加快速簡(jiǎn)便，本研究建立的ASFV LAMP檢測(cè)方法反應(yīng)時(shí)間為50 min，快速熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)間約為65 min， LAMP檢測(cè)方法比熒光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間節(jié)省15 min，靈敏度與熒光定量PCR檢測(cè)方法持平。任名等[13]通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化，建立了ASFV Taqman探針?lè)晒舛縋CR檢測(cè)方法，靈敏度可以達(dá)到10 copies/μL，反應(yīng)時(shí)間約為1 h。同時(shí)，ASFV LAMP可視化檢測(cè)方法可在恒溫水浴設(shè)備、PCR儀器中進(jìn)行操作，均可檢出10 copies/μL病毒含量，并能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。既可滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)條件，也可在實(shí)驗(yàn)室利用PCR檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行結(jié)果判定，具有很強(qiáng)的實(shí)用性與便捷性。

綜上，本研究建立的ASFV LAMP檢測(cè)方法具有速度快、靈敏度高、不受實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備限制、結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床非洲豬瘟病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。