梅士俊，曾洪波，金巍，毛勝勇

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實驗室，江蘇 南京 210095)

在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖條件下，為滿足消費者對肉制品不斷增長的需求，實現(xiàn)養(yǎng)殖利潤的最大化，肉羊企業(yè)逐步使用全混合顆粒日糧替代傳統(tǒng)全混合日糧。與傳統(tǒng)全混合日糧相比，顆?；旌先占Z可充分利用地源性農(nóng)副產(chǎn)品等非常規(guī)飼料資源，更便于大規(guī)模生產(chǎn)運輸儲存，還可縮減規(guī)模化養(yǎng)殖條件下的人工成本，提高養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟效益[1]。因此，全混合顆粒飼料在肉羊養(yǎng)殖業(yè)中得到了大量應(yīng)用。但是，顆?；占Z的使用也引起了一些營養(yǎng)健康問題。例如，由于顆粒化日糧在制粒過程會促進淀粉糊化，這在一定程度上提高了日糧在瘤胃中的發(fā)酵速度[2]，增加了動物發(fā)生瘤胃酸中毒的風(fēng)險[3]。同時，顆粒料還導(dǎo)致日糧中物理有效中性洗滌纖維的含量下降，降低咀嚼次數(shù)、反芻時間和唾液的分泌量，從而進一步影響瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[4]。

碳酸氫鈉是一種相對安全、價格低廉的強堿弱酸鹽，在動物體內(nèi)可解離為碳酸氫根，增加機體的堿貯從而緩解瘤胃酸中毒狀況，其還能在一定程度上提高畜禽生長性能以及抗熱應(yīng)激的能力。Hu等[5]研究顯示，奶牛日糧中添加碳酸氫鈉可顯著提高干物質(zhì)采食量、乳脂率以及乳脂產(chǎn)量。Xu等[6]和Khorasani等[7]研究發(fā)現(xiàn)，泌乳后期奶牛日糧中添加碳酸氫鈉可提高4%乳脂校正乳的產(chǎn)量。Cruywagen等[8]研究表明，奶牛日糧中添加0.8%的碳酸氫鈉可降低瘤胃pH值小于5.5的時間、丙酸的摩爾比例以及乳酸的濃度。日糧中添加一定比例的碳酸氫鈉可以提高反芻動物的生產(chǎn)性能，增加企業(yè)的經(jīng)濟效益。

然而，目前尚不清楚在使用全混合顆粒料日糧這種新的肉羊飼養(yǎng)模式下，使用碳酸氫鈉是否具有改善肉羊瘤胃健康的作用。為此，本文選用育肥期湖羊為研究對象，研究了高精料全混合顆粒飼料中添加碳酸氫鈉對湖羊生長性能、瘤胃發(fā)酵和細菌菌群結(jié)構(gòu)的影響，為闡明碳酸氫鈉在肉羊飼料配方中的合理應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗于2018年12月19日至2019年1月24日在江蘇省徐州蘇羊羊業(yè)有限公司進行。選用健康的3月齡育肥期湖羊16頭，平均體重(29.00±2.87) kg，隨機分為2組，每組8頭，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)為2頭，各重復(fù)飼養(yǎng)于同一欄中。其中：對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組在基礎(chǔ)日糧中添加0.5%的碳酸氫鈉(南京致潤生物科技有限公司)。2組日糧均制成全混合顆粒料，基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)水平參照《肉羊飼養(yǎng)標準(NY/T816—2004)》[9],詳見表1。預(yù)飼期5 d，正試期30 d。每天飼喂2次(8:00和16:00)，自由采食和飲水。試驗期間，每日的剩料量控制在采食量的10%左右，每日記錄采食量。試驗開始和結(jié)束時，對各組羊分別進行稱重。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成成分及營養(yǎng)水平(絕干基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

試驗結(jié)束后，分別從每個重復(fù)中隨機挑選1頭羊，于當天晨飼后4 h屠宰采樣，采集瘤胃內(nèi)容物裝入高溫滅菌的5 mL離心管，存儲于-20 ℃冰箱用于后續(xù)提取微生物DNA。另取部分瘤胃內(nèi)容物，經(jīng)四層紗布過濾，一部分過濾所得的瘤胃液立即測定pH值，另一部分瘤胃液裝入5 mL離心管，-20 ℃冰箱冷凍保存，用于揮發(fā)性脂肪酸的測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 瘤胃液樣品中揮發(fā)性脂肪酸的測定

瘤胃液樣品中揮發(fā)性脂肪酸濃度的測定參照文獻[10]的方法。

1.3.2 瘤胃微生物DNA提取

瘤胃微生物的DNA提取參照文獻[11]。采用CTAB結(jié)合酚-氯仿-異戊醇法提取。使用NanoDrop ND-2000(Thermo Fisher Scientific，USA)測定DNA濃度和純度，保證提取的樣品DNA的OD260/280在1.80～2.00之間，保存DNA樣品于-80 ℃冰箱備用。

1.3.3 細菌16S rRNA基因的高通量測序及數(shù)據(jù)分析

對細菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)進行PCR擴增，引物序列為341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。擴增產(chǎn)物利用Illumina MiSeq PE250平臺進行測序(凌恩生物科技有限公司，上海)。

高通量數(shù)據(jù)分析參照文獻[12]，利用QIIME軟件(1.9.0版)進行。利用UPARSE在0.03水平上聚類OTU[13]，α和β多樣性分析在序列深度28 482上進行?；赨nweighted UniFrac Metric進行主坐標(PCoA)分析[14]?；赟ILVA 數(shù)據(jù)庫(Release13.2 http://www.arb-silva.de)對OTU的代表性序列進行系統(tǒng)分類[15]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel(2016)初步整理后，生長性能數(shù)據(jù)結(jié)果使用SPSS 22.0軟件中GLM模型進行統(tǒng)計，瘤胃發(fā)酵數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析，瘤胃微生物數(shù)據(jù)結(jié)果使用SPSS 22.0軟件中的Kruskal-Wallis H(K)非參數(shù)檢驗進行差異分析。P<0.05表示差異顯著，0.05≤P≤0.10表示有變化趨勢，P>0.10表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 添加碳酸氫鈉對湖羊生長性能的影響

如表2所示，與對照組相比，日糧中添加碳酸氫鈉顯著提高了湖羊平均日增重(P<0.05)，總增重和平均日采食量有增加的趨勢(P<0.10)，料重比有下降的趨勢(P<0.10)。

表2 添加碳酸氫鈉對湖羊生長性能的影響

2.2 添加碳酸氫鈉對湖羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

如表3所示，與對照組相比，試驗組瘤胃pH值顯著提高(P<0.05)，總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著降低(P<0.05)，乙酸濃度有降低的趨勢(P<0.10)，其他揮發(fā)性脂肪酸濃度無顯著差異(P>0.05)。乙酸比例、丙酸比例、丁酸比例和乙酸/丙酸無顯著差異(P>0.05)。

表3 添加碳酸氫鈉對湖羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3 添加碳酸氫鈉對湖羊瘤胃細菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 湖羊瘤胃細菌菌群的測序深度分析

由圖1可知，稀釋曲線趨于平緩，表明測序深度和數(shù)據(jù)量充足，能夠覆蓋大多數(shù)菌。

圖1 所有樣本的稀釋曲線

2.3.2 湖羊瘤胃細菌菌群的多樣性分析

如表4所示，與對照組相比，添加碳酸氫鈉對湖羊瘤胃細菌的α多樣性指數(shù)無顯著影響(P>0.05)。PCoA分析的結(jié)果顯示，兩組樣品沒有被明顯區(qū)分開來，暗示添加碳酸氫鈉對瘤胃細菌菌群結(jié)構(gòu)的影響較小(圖2)。

表4 添加碳酸氫鈉對瘤胃細菌菌群α多樣性的影響

圖2 瘤胃細菌菌群結(jié)構(gòu)的主坐標成分分析

2.3.3 門水平細菌豐度變化

由表5可見，全部樣品共檢測出15個門，2個組的優(yōu)勢菌群均為厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，這3個門的相對豐度均在5%以上。與對照組相比，試驗組中TM7菌門相對豐度有上升的趨勢(P<0.10)，其他門的相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

2.3.4 屬水平細菌豐度變化

由表6可得，相對豐度大于1%的屬有23個。2個組的普雷氏菌屬、未分類瘤胃球菌屬、丁酸弧菌屬和瘤胃球菌屬相對豐度均在5%以上。與對照組相比，試驗組未分類韋榮氏菌科的相對豐度顯著降低(P<0.05)，未分類克里斯滕森菌科的相對豐度有上升的趨勢(P<0.10)，其他屬的相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

表5 添加碳酸氫鈉對瘤胃細菌門水平相對豐度的影響

表6 添加碳酸氫鈉對瘤胃細菌屬水平相對豐度的影響

2.3.5 OTU水平細菌豐度變化

由表7可得，相對豐度大于1%的優(yōu)勢OTU有28個。對照組中相對豐度>2.0%的OTU有：OTU2(4.30%, 普雷沃氏菌屬, 擬桿菌門)、OTU8(3.73%, 瘤胃球菌屬, 厚壁菌門)、OTU7(3.69%, 普雷沃氏菌屬, 擬桿菌門)、OTU15(3.21%, 普雷沃氏菌屬, 擬桿菌門)、OTU5(2.15%, 丁酸弧菌屬，厚壁菌門)、OTU3(2.11%, 未分類瘤胃球菌屬,厚壁菌門)、OTU12(2.09%, 未分類BS菌屬, 擬桿菌門)。試驗組中相對豐度>2.0%的OTU有：OTU1(5.68%, 普雷沃氏菌屬, 擬桿菌門)、OTU2(3.58%, 普雷沃氏菌屬, 擬桿菌門)、OTU5(2.59%, 丁酸弧菌屬, 厚壁菌門)、OTU11(2.56%, 瘤胃球菌屬, 厚壁菌門)、OTU3(2.12%, 未分類瘤胃球菌科, 厚壁菌門)、OTU4(2.09%,丁酸弧菌屬，厚壁菌門)。與對照組相比，試驗組的OTU24(0.07%, 解琥珀酸菌屬, 厚壁菌門)的相對豐度有降低的趨勢(P<0.1)。

表7 添加碳酸氫鈉對湖羊瘤胃細菌優(yōu)勢OTU相對豐度的影響

3 討論

碳酸氫鈉作為一種飼料添加劑，已在畜禽飼料中得到廣泛的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，奶牛日糧中添加碳酸氫鈉，可提高其干物質(zhì)采食量[16]、產(chǎn)奶量[16-17]和乳脂含量[18]。但是目前關(guān)于在全混合顆粒料日糧條件下添加碳酸氫鈉對肉羊生長性能影響的研究較少，本文添加0.5%的碳酸氫鈉顯著提高了育肥期湖羊的平均日增重，提示在全混合顆粒日糧條件下添加適宜水平的碳酸氫鈉有助于提高湖羊的生長性能。

反芻動物日糧中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物如淀粉含量過高或者飼草粉碎過細，瘤胃發(fā)酵過快，pH值迅速降低，進而可能誘發(fā)瘤胃酸中毒。同時較低的pH值會導(dǎo)致纖維降解率降低[19]。本文中瘤胃pH值低于5.8，暗示湖羊可能處于亞急性瘤胃酸中毒狀態(tài)。添加0.5%的碳酸氫鈉雖然升高了pH值，但升高的幅度較小，pH值仍然處于較低水平，在這一瘤胃環(huán)境條件下，纖維降解很可能會受到抑制。有研究報道，奶牛日糧中添加碳酸氫鈉緩沖液改變了瘤胃揮發(fā)性脂肪酸譜，提高了乙酸濃度，降低丙酸濃度，提高乙酸丙酸比[20]，其原因可能是碳酸氫鈉升高了瘤胃pH值，促進了纖維降解利用，導(dǎo)致乙酸生成量增加。本文中添加0.5%的碳酸氫鈉未改變瘤胃揮發(fā)性脂肪酸譜，這可能與纖維降解利用受到抑制有關(guān)。

瘤胃微生物菌群組成和結(jié)構(gòu)對維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。本試驗結(jié)果顯示，添加碳酸氫鈉使瘤胃中未分類韋榮氏菌科的相對豐度顯著降低，未分類克里斯滕森菌科的相對豐度有升高的趨勢。Golder等[21]發(fā)現(xiàn)韋榮氏菌科的相對豐度與母牛瘤胃中乳酸濃度呈正相關(guān)。Stewart等[22]報道，韋榮氏菌科中的某些屬能夠利用乳酸。因此，未分類韋榮氏菌科可能與瘤胃中乳酸利用有關(guān)。de Nardi等[23]研究表明，克里斯滕森菌科微生物的相對豐度隨母牛瘤胃pH值的降低而升高。這與本次試驗所得的結(jié)果不一致，具體的原因有待進一步研究論證。同時在屬水平和OTU水平上，兩組之間存在顯著差異的微生物屬和OTU也極少。這些結(jié)果說明，在本試驗采用全混合顆粒料日糧飼喂條件下，添加碳酸氫鈉并未導(dǎo)致湖羊瘤胃微生物的組成、結(jié)構(gòu)及多樣性指數(shù)發(fā)生顯著變化。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能與2組湖羊瘤胃pH值均低于5.8有關(guān)。相關(guān)研究表明，瘤胃pH值處于5.8以上，瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)相對平衡，瘤胃處于健康狀態(tài)[24]；當瘤胃pH值低于5.8時，瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)處于失衡狀態(tài)[25]。本試驗中，2組湖羊瘤胃pH值均處于5.8以下，說明本試驗條件下，添加的碳酸氫鈉對瘤胃微生態(tài)失衡并沒有起到改善作用。這些結(jié)果也進一步說明，導(dǎo)致肉羊生長性能改善更可能與瘤胃pH值提高有關(guān)，與瘤胃微生物菌群的變化之間可能無直接相關(guān)。

4 結(jié)論

綜上所述，全混合顆粒料日糧添加0.5%碳酸氫鈉可提高育肥期湖羊的生長性能，提高瘤胃pH值，但對瘤胃細菌菌群的結(jié)構(gòu)和組成影響較小。