譚守勇

呼吸疾病國家重點實驗室、廣州市胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科(廣東廣州 510095)

肺結(jié)核病是重大呼吸道傳染性疾病，是指發(fā)生在肺組織、氣管、支氣管和胸膜的結(jié)核病變。據(jù)WHO估算[1]，2019年全球約有1 000萬人患結(jié)核病，其中我國約有83.3萬人患結(jié)核病。其患病人數(shù)約為2020年我國新冠肺炎患病人數(shù)10倍。減少肺結(jié)核發(fā)病和死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是“早診斷、早隔離、早治療”，早診斷可以減少個體治療延誤和結(jié)核分枝桿菌(MTB)在社區(qū)的傳播。肺結(jié)核診斷以細菌學和分子生物學的病原學檢查為主，結(jié)合流行病學、臨床表現(xiàn)、胸部影像和相關(guān)的輔助檢查等結(jié)果，通過鑒別診斷和綜合分析才能明確診斷。因此，結(jié)核病的病原學檢測是至關(guān)重要。由于大多數(shù)肺結(jié)核病臨床表現(xiàn)不典型、胸部影像學表現(xiàn)特異性差，這可能導致肺結(jié)核病漏診及誤診。據(jù)WHO在2020全球結(jié)核報告[1]，2019年登記590萬例肺結(jié)核患者中，僅有57%經(jīng)細菌學證實。我國新發(fā)及復(fù)發(fā)的病例有72.8萬例，僅47%通過細菌學證實，31%采用分子生物學快速診斷方法作為診斷手段。因此，WHO呼吁各國應(yīng)增加細菌學確診病例的百分比，減少結(jié)核病漏診率有效控制結(jié)核病疫情。

1 肺結(jié)核病病原學的診斷概況

目前肺結(jié)核病的病原學診斷在我國醫(yī)療基層單位仍以抗酸涂片鏡檢及分枝桿菌培養(yǎng)為主：(1)抗酸涂片鏡檢，需標本中菌量至少5 000～10 000條/mL時，結(jié)果才可呈陽性；而且由于分枝桿菌抗酸性是菌體內(nèi)的分枝菌酸、RNA蛋白及其細菌細胞壁的完整性相結(jié)合的綜合反應(yīng)，即抗酸性的強弱與細菌細胞壁的完整性、細菌成熟和衰老程度均有關(guān)系，故抗酸涂片鏡檢的檢出率、敏感性較低，但因其技術(shù)簡單、操作性強、費用低、檢測快速和能確定感染部位等優(yōu)點，現(xiàn)仍作為臨床篩查肺結(jié)核的首選檢測項目。(2)分枝桿菌培養(yǎng)的檢出率較高，但因培養(yǎng)時間長，影響早診斷及早治療，且可能會出現(xiàn)污染。即使培養(yǎng)陽性仍需進行菌種鑒定。筆者曾對2010—2012年結(jié)核病防治機構(gòu)初治抗酸涂片鏡檢陽性及分枝桿菌培養(yǎng)陽性2 014例進行分枝桿菌菌種鑒定進行分析[2]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)384例(19.1%)為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。因而，臨床上對肺結(jié)核的細菌學確診的患者，需要分枝桿菌培養(yǎng)陽性后進行菌種鑒定證實為復(fù)合結(jié)核菌群才能確診，通常需要45 d左右。

精準醫(yī)學通過高通量的基因組、蛋白質(zhì)組等組學技術(shù)和醫(yī)學前沿信息技術(shù)，對大樣本人群與特定疾病進行生物標志物的分析與鑒定、驗證與應(yīng)用，從而精確尋找到疾病的病因及治療的靶點，并對同一種疾病不同狀態(tài)和過程進行精確亞分類，實現(xiàn)對于疾病和特定患者進行個性化精準治療[3]。結(jié)核病病原學分子生物學診斷技術(shù)通過檢測臨床標本，以結(jié)核分枝桿菌相關(guān)基因為診斷標志物，檢測標本中是否含有結(jié)核分枝桿菌核酸或MTB耐藥基因。這種檢測診斷技術(shù)彌補了MTB生長緩慢對檢測周期的影響，同時對實驗室的生物安全要求低于多種傳統(tǒng)的細菌學診斷方法。因此，2013年WHO修訂了結(jié)核病的診斷標準，將分子生物學診斷陽性患者納入病原學陽性的范疇[4]；我國也在《肺結(jié)核診斷(WS288-2017)》中進行了相應(yīng)的修訂[5]。2020年6月WHO在結(jié)核病的有關(guān)快速診斷指南中指出[6]：開展分子生物學診斷，其目是增加經(jīng)細菌確認的結(jié)核病病例的百分比(基于擴大使用比涂片顯微鏡更敏感的推薦診斷)，減少結(jié)核病誤診。

2 分子生物學檢測在肺結(jié)核精準診斷中的作用

目前，分子生物學已在我囯結(jié)核病專科醫(yī)療機構(gòu)廣泛應(yīng)用。MTB分子生物學診斷主要靶標為MTB基因組中特有保守的管家基因，常用IS6110、16S核糖體RNA(16SrRNA)、gyrB、rpoB等靶標基因[7]。有學者研究提出[8]，縣區(qū)級具備分子MTB生物學核酸檢測能力，其病原學陽性率(40.5%)較不具備MTB分子生物學核酸檢測能力高(37.4%)，且檢測時間僅需2～3 h，在提高對患者確診率的同時能夠大大縮短診斷時間。

分子生物學檢測MTB包括MTB-DNA和MTB-RNA檢測兩種。各種MTB分子生物學診斷技術(shù)比較見表1。表1中前5項均為檢測MTB-DNA，而后1項是檢測MTB-RNA。有學者對疑似肺結(jié)核347例患者及確診肺結(jié)核172例患者同時采用MTB培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF、實時熒光PCR等溫擴增技術(shù)進行比較分析[9]。在疑似肺結(jié)核病患者和確診肺結(jié)核病患者中，其MTB培養(yǎng)陽性率為21.6%和45.4%，而聯(lián)合分子生物學檢測后其陽性率達到28.5%～33.1%和57.6%～62.2%。然而，由于該研究的是MTB-DNA，不能鑒別是活菌或死菌，特別在復(fù)治肺結(jié)核患者診斷上，要注意排除肺結(jié)核是否復(fù)發(fā)。TB-RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)檢測可快速檢測標本中的MTB,并且可判斷是否為活MTB。筆者前期研究報道[10]，將242例疑似肺結(jié)核患者(疑似肺結(jié)核組),與臨床已排除肺結(jié)核肺部其他疾病患者96例(對照組)進行分析。發(fā)現(xiàn)疑似肺結(jié)核組242例中痰培養(yǎng)陽性233例,其中菌種鑒定MTB感染者222例,NTM感染者11例；痰培養(yǎng)結(jié)果陰性9例。對照組痰培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。疑似肺結(jié)核組菌種鑒定為MTB感染222例TB-RNA檢測陽性192例,與菌種鑒定符合率為86.5%(192/222)；NTM感染11例TB-RNA檢測陽性0例(0/11),與菌種鑒定符合率為100.0% (11/11)；對照組TB-RNA檢測陽性者2例(2.1%,2/96),與分枝桿菌培養(yǎng)符合率為97.9%(94/96)。TB-RNA檢測在疑似肺結(jié)核患者診斷中的敏感度為86.5%(192/222),特異度為97.9% (94/96)。因TB-RNA是檢疫結(jié)核分枝桿菌的RNA，因此，其陽性結(jié)果提示為活動性肺結(jié)核。

表1 各種結(jié)核分子生物學診斷技術(shù)比較(培養(yǎng)為金標準)

全基因組測序(WGS)方法是利用DNA測序平臺重新構(gòu)建生物體基因組的完整DNA序列。國內(nèi)有學者對105例疑似結(jié)核病患者采用分枝桿菌培養(yǎng)、WGS和GeneXpert檢測并與臨床最終診斷相比[11]，WGS對所有活動性結(jié)核病病例的敏感性為44%，與GeneXpert(42%)相似。中國宏基因組學第二代測序技術(shù)檢測感染病原體的臨床應(yīng)用專家共識明確[12]：對于結(jié)核分枝桿菌等胞內(nèi)菌,二代測序的檢測效能會相對降低,應(yīng)對上述菌群設(shè)置特定的序列數(shù)閾值。

因而，在臨床上對于疑似肺結(jié)核患者除應(yīng)進行抗酸涂片鏡檢及分枝桿菌培養(yǎng)外，應(yīng)采用MTB分子生物學檢測。(1)若細菌學檢查陽性和分子生物學檢測陽性，即可診斷肺結(jié)核。(2)若細菌學檢查陽性和分子生物學檢測(TB-DNA)陰性，注意排除NTM感染，可再次收集標本重復(fù)檢測，或用敏感度更高的分子生物學方法進行檢測。(3)若細菌學檢查陰性和分子生物學檢測陽性，無結(jié)核病治療史患者，可再次收集標本重復(fù)檢測；如有肺結(jié)核治療史患者應(yīng)了解患者既往臨床和影像學資料及與近期的臨床和影像學資料關(guān)聯(lián)性，進行綜合診斷。(4)不推薦常規(guī)使用全基因組測序。

3 分子生物學檢測在肺結(jié)核耐藥性精準診斷中的作用

全球2019年登記報告耐多藥/利福平耐藥(MDR-TB/RR-TB)患者206 030例，占估算MDR-TB/RR-TB發(fā)病總數(shù)46.5萬之44%[1]。因此，早期發(fā)現(xiàn)MDR/RR-TB、廣泛耐多藥結(jié)核病(XDR-TB)是結(jié)核病控制的重點。2020年10月27—29日，WHO組織了關(guān)于廣泛耐藥結(jié)核病定義的專家線上研討會[13]，再次明確耐多藥指異煙肼及利福平耐藥，并修訂了pre-XDR-TB以及XDR-TB定義。(1)pre-XDR-TB:由符合MDR/RR-TB定義、同時對任意氟喹諾酮類藥物耐藥的MTB菌株引起的結(jié)核??；(2)XDR-TB:由符合MDR/RR-TB定義、同時對任意氟喹諾酮類藥物以及至少一種其他的A組藥物(氟喹諾酮類藥物、利奈唑胺及貝達喹啉)耐藥的MTB菌株引起的結(jié)核病。因此，在結(jié)核病耐藥性診斷方面，主要針對MDR/RR-TB及XDR-TB的耐藥情況。

MTB耐藥分子生物學檢測主要是針對常用和已知的抗結(jié)核藥物耐藥靶基因突變，包括藥物靶標基因和參與藥物活化基因。然而，由于MTB耐藥分子生物學檢測無法確定標本中耐藥細菌的比例，可能難以從患者體內(nèi)同時分離出敏感菌株和耐藥菌株[14]。因此，分子生物學檢測不能完全取代傳統(tǒng)表型藥物敏感試驗，可作為耐藥MTB快速篩查方法和(或)傳統(tǒng)藥物敏感試驗的補充。目前，我國醫(yī)療機構(gòu)主要開展下列4種生物學檢測[7]，其生物學檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥敏感度見表2。

表2 4種生物學檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥敏感度

分子生物學檢測耐藥可以實現(xiàn)耐藥結(jié)核病的快速診斷，但檢測的敏感性依賴于檢測耐藥突變位點的數(shù)量。然而，WGS可檢測目前所有已知的耐藥相關(guān)突變。有學者為探討WGS檢測一線和二線耐藥抗結(jié)核藥物診斷準確性，對2005—2015年10年間發(fā)表的20篇文獻薈萃分析[15]。一線抗結(jié)核藥物利福平耐藥敏感度和特異度檢測值分別為0.98(95%CI0.93～0.98)、0.98(95%CI0.98～1.00)、異煙肼耐藥敏感度和特異度分別為0.97(95%CI0.94～0.99)和0.93(95%CI0.91～0.96)；其他一線藥物其耐藥敏感度和特異度檢測值變異較大。氟喹諾酮類(FQs)藥物敏感度和特異度分別為0.89(95%CI0.80～1.00)和1.00。作者提出，WGS可被認為是現(xiàn)有的利福平和異煙肼表型和分子藥敏試驗方法的一種有前途的替代方法。然而，WGS對核酸總量和質(zhì)量要求很高，其測序失敗率高于PCR和線性探針的傳統(tǒng)分子檢測手段；而且由于分析流程繁瑣、數(shù)據(jù)量過大導致分析時間遠長于預(yù)期(需要21 d)，與傳統(tǒng)診斷方法20 d比較，WGS并沒有縮短檢出時間[16]。

因此，臨床上對肺結(jié)核患者必需進行MTB分子生物學耐藥性檢測。(1)若細菌學藥物敏感試驗和MTB分子耐藥性檢測結(jié)果一致，相應(yīng)結(jié)果可作為待測菌株對相應(yīng)藥物耐受性的判定依據(jù){14}。(2)MTB分子生物學耐藥性檢測對RFP、INH和FQs耐藥、細菌學藥物敏感試驗敏感；初治患者再次收集標本重復(fù)分子生物學耐藥性檢測，耐藥者可診斷為耐藥性肺結(jié)核?。幻舾姓呖山Y(jié)合臨床可診斷為非耐藥性肺結(jié)核病。復(fù)治者結(jié)合既往臨床和影像學資料及與近期的臨床和影像學資料，可診斷為耐藥性肺結(jié)核病。(3)MTB分子生物學耐藥性檢測對RFP、INH和FQs敏感、細菌學藥物敏感試驗?zāi)退幙膳袛酁镸TB的異質(zhì)性耐藥。(4)不推薦常規(guī)使用WGS。

綜上所述，肺結(jié)核病作為一種傳染性疾病，其診斷延誤可導致結(jié)核病在社區(qū)中暴發(fā)。合理應(yīng)用分子生物學檢測MTB可達到早期診斷和精準診斷，是控制結(jié)核病的關(guān)鍵。在結(jié)核病和利福平耐藥結(jié)核病患者中，應(yīng)至少分別對異煙肼和氟喹諾酮類藥物的額外耐藥性開展及時檢測，以指導治療決策[17]。