郭良煜，余 鈴，陳敬騰，龔長(zhǎng)天，施玉博，郭衛(wèi)春

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院 骨科， 武漢 430060)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是來(lái)源于骨組織的惡性腫瘤，多見(jiàn)于青少年和兒童，發(fā)生部位在長(zhǎng)骨遠(yuǎn)端，在早期就容易產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲[1-2]。大約15%～20%的患者在早期就診時(shí)可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。肺是最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位，占轉(zhuǎn)移疾病的85%以上，而骨骼是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的第二常見(jiàn)部位。近幾年來(lái)化療藥物的使用雖然提高了骨肉瘤患者的生存率和生活質(zhì)量，但患者對(duì)化療藥物產(chǎn)生的耐藥性和較高的毒副作用仍然是難解決的問(wèn)題[3]。 因此，急需新的藥物進(jìn)行治療。

染料木素(Genistein)是一種天然存在于水果、堅(jiān)果和大豆中的物質(zhì)，前期的許多研究表明了它能有效的抑制乳腺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌，腦癌以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病的活性[4]。同時(shí)染料木素也能夠通過(guò)抑制炎癥、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)類固醇激素受體和代謝途徑等方面來(lái)降低腫瘤細(xì)胞的活性和數(shù)量[5]。染料木素的抗腫瘤能力在許多癌癥中都得等到了體現(xiàn)，但在骨肉瘤的研究中卻很少見(jiàn)。

近幾年來(lái)開(kāi)始使用生物信息學(xué)的方法來(lái)篩選藥物可能作用的靶基因，在通過(guò)靶基因與腫瘤之間的關(guān)系來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)腫瘤是否有作用，例如利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)白黎蘆醇作用于前列腺癌的靶基因[6]；用生物信息學(xué)方法來(lái)篩選對(duì)乳腺癌治療有用的藥物和它們的靶基因[7]。本研究在DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選染料木素作用的靶基因。經(jīng)過(guò)一系列方法篩選出CXCL8,CXCL12,LPAR1和CNR1；hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p和hsa-miR-200a-3p作為染料木素在骨肉瘤中最重要的靶基因，對(duì)于靶向治療的前景具有重要價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 選擇藥物相關(guān)的靶基因

DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)是一個(gè)全面的、可以免費(fèi)訪問(wèn)的、包含藥物和藥物靶基因的在線數(shù)據(jù)庫(kù)。它是生物信息學(xué)和化學(xué)信息學(xué)的詳細(xì)來(lái)源，它將藥物數(shù)據(jù)和藥物靶標(biāo)的信息相結(jié)合，它總共包含13 494種藥物，其中包括2 638種已經(jīng)批準(zhǔn)的小分子藥物，1 367種批準(zhǔn)的生物制劑(蛋白質(zhì)，多肽，疫苗和能引起過(guò)敏的過(guò)敏原)，131種營(yíng)養(yǎng)藥品和至少6 347種正進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的藥物[8]。用DrugBank用于搜索與染料木素相關(guān)的靶基因。

1.2 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和篩選關(guān)鍵基因

String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/cgi/input.pl)是構(gòu)建蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的常用數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，將基因上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)，從而構(gòu)建蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)圖[9]。Cytoscape軟件是一款可以將PPI可視化的軟件，并且具有多種功能強(qiáng)大的插件，可以繼續(xù)對(duì)PPI進(jìn)行后續(xù)的分析和編輯。將與染料木素有關(guān)的基因?qū)氲絪tring數(shù)據(jù)庫(kù)中，單個(gè)基因連接數(shù)不超過(guò)35個(gè)同時(shí)基因與基因之間的關(guān)聯(lián)最低為0.7。隨后將string數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape(http://www.cytoscape.org/)中得到PPI圖。隨后用插件CytoHubba來(lái)對(duì)PPI網(wǎng)路進(jìn)行相互作用分析，篩選出排名前25的關(guān)鍵基因。

1.3 Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG)分析

WebGestalt (http://www.webgestalt.org)和DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)相似，是一個(gè)全面的進(jìn)行GO和KEGG功能分析的網(wǎng)站[10]，更新比DAVID及時(shí)。將25個(gè)關(guān)鍵基因?qū)氲絎ebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)中，以P<0.05為基準(zhǔn)篩選信號(hào)通路，最終選出10個(gè)基因信號(hào)通路。

1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證關(guān)鍵靶基因

HCMDB (Human Cancer Database)是一個(gè)用于存儲(chǔ)和分析腫瘤的數(shù)據(jù)庫(kù)。從GEO和TCGA中收集了124個(gè)以前發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集。它包含了29種癌癥類型。將得到的關(guān)鍵靶基因輸入HCMDB中進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 預(yù)測(cè)靶基因的miRNA和驗(yàn)證

將驗(yàn)證后的靶基因輸入到miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)中，miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)是可以進(jìn)行mRNA和miRNA預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選條件為target score≥80。隨后將得到的miRNA在GSE65071數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果分析

2.1 與染料木素相關(guān)的靶基因

表1詳細(xì)展示了染料木素在DrugBank里的信息，是屬于小分子物質(zhì)，分子量為270.236 9，同時(shí)它可以抑制蛋白酪氨酸激酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶-II(DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，II型)的活性，所以可以作為抗腫瘤的藥物。在實(shí)驗(yàn)上，它已經(jīng)顯示出在人和鼠細(xì)胞系中可以誘導(dǎo)G2期停滯，而阻滯細(xì)胞周期也是誘導(dǎo)凋亡的一個(gè)重要途徑，目前正在進(jìn)行前列腺癌的研究，表2展現(xiàn)出了與染料木素有關(guān)的13個(gè)基因，分別是ESR2,TOP2A,PTK2B,NCOA1,ESR1,NCOA2,ESRRA,ESRRB,NR1I2,AKT1,GPER1,CYP1B1和SHBG，在其中選擇對(duì)基因作用仍不是很明確的靶基因，因此，最終選出11個(gè)與染料木素有關(guān)的靶基因。

2.2 染料蘇木靶基因PPI圖和相關(guān)基因

將所選取的11個(gè)靶基因?qū)雜tring數(shù)據(jù)庫(kù)中，隨后刪除重復(fù)的蛋白，得到了284個(gè)與11個(gè)靶基因有關(guān)的基因(見(jiàn)圖1a)，用Cytoscape插件中的CytoHubba來(lái)分析，得出在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中排名前25的基因，這25個(gè)基因就是關(guān)鍵基因(見(jiàn)圖1b)，分別為CXCL8，GRM4，GPER1，OPRK1，GRM7，OPRD1，SST，GRM3，LPAR1，CXCL12，GRM8，CASR，GPR37，GPR17，GPR18，GRM6，CNR1，DRD2，APP，BDKRB2，KNG1，OPRL1，PNOC，DRD3，AGT。

表1 染料木素在DrugBank里的信息Table 1 Information on genistein in DrugBank

圖1 PPI圖和25個(gè)關(guān)鍵基因Fig. 1 PPI network and 25 key genes

表2 染料木素的靶基因信息Table 2 Target gene information of genistein

2.3 KEGG分析

將25個(gè)關(guān)鍵基因?qū)氲絎ebGestalt中，以P<0.05為基準(zhǔn)篩選出信號(hào)通路，最終得到了10個(gè)與關(guān)鍵基因有關(guān)的信號(hào)通路(見(jiàn)圖2)，分別為神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Pvalue為7.016 609 515 630 98×10-14)；磷脂酶D信號(hào)通路(Pvalue為1.259 889 412 796 86×10-7)；谷氨酸能突觸(Pvalue為1.623 606 752 154 67×10-5)；可卡因成癮(Pvalue為8.957 925 689 391 24×10-3)；Rap1信號(hào)通路(Pvalue為2.163 675 640 824 39×10-2)；補(bǔ)體途徑(Pvalue為2.225 309 023 143 79×10-2)；肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)(Pvalue為2.361 391 695 821 74×10-2)；細(xì)胞間隙連接(Pvalue為2.721 187 625 285 12×10-2)；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Pvalue為2.836 966 674 350 58×10-2)；NF-kappa B信號(hào)通路(Pvalue為3.135 002 865 670 41×10-2)(見(jiàn)表3)。在這些通路中，NF-kappa B和Rap1信號(hào)通路在骨肉瘤中研究較多，例如骨肉瘤差異基因的分析也證實(shí)了差異基因主要存在于Rap1信號(hào)通路[12]，同時(shí)也有文獻(xiàn)證實(shí)了類黃酮B可以通過(guò)抑制NF-kappa B信號(hào)通路從而使得骨肉瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性提高[13]。因此，選取這兩個(gè)信息通路所在的基因，進(jìn)行下一步的分析。

圖2 KEGG富集分析結(jié)果Fig.2 Results of KEGG enrichment analysis

2.4 驗(yàn)證靶基因

將最后得到的5個(gè)靶基因輸入HCMDB數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行驗(yàn)證，最后發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因在骨肉瘤中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分別是CXCL8,CXCL12,LPAR1和CNR1(見(jiàn)圖3)。

表3 KEGG富集分析結(jié)果Table 3 Results of KEGG enrichment analysis

圖3 CXCL8, CXCL12, LPAR1和CNR1數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證(*P<0.05)Fig. 3 Verification of CXCL8, CXCL12, LPAR1, and CNR1 in database(*P<0.05)

2.5 預(yù)測(cè)靶基因的miRNA和數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證

將驗(yàn)證后的4個(gè)靶基因利用miRDB進(jìn)行miRNA預(yù)測(cè)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為與靶基因的target score≥80，得到了mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖4)。其中選取與4個(gè)靶基因關(guān)聯(lián)程度高的5個(gè)miRNA：hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p，hsa-miR-200a-3p和has-miR-4524a-3p。隨后將5個(gè)miRNA用GSE65071進(jìn)行驗(yàn)證，最后得到4個(gè)miRNA：hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p，hsa-miR-200a-3p(見(jiàn)圖5)。

圖4 mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Regulation network diagram of mRNA-miRNA

圖5 hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p，hsa-miR-200a-3p在GSE65071驗(yàn)證(*P<0.05)Fig. 5 Verification of hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-23a-3p, and hsa-miR-141-3p, hsa-miR-200a-3p in GSE65071(*P<0.05)

3 討 論

骨肉瘤惡性程度較高，發(fā)病率較低但死亡率較高。當(dāng)前的治療主要以手術(shù)切除加術(shù)前術(shù)后放化療為金標(biāo)準(zhǔn)，但治療效果往往不佳，主要是因?yàn)榛颊叩哪褪芎突熕幬飮?yán)重的毒副作用[3]。染料木素是一種天然的小分子物質(zhì)，在前期的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)染料木素可以抑制多種腫瘤的活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過(guò)生物信息學(xué)的方法來(lái)分析染料木素調(diào)控骨肉瘤可能的信號(hào)通路和可能的靶基因，為后續(xù)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。

首先在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取與染料蘇木有關(guān)的靶基因，后將與染料蘇木有關(guān)的靶基因?qū)氲絪tring數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析，用Cytoscape中的插件Cytohubb進(jìn)行分析，獲得排名前25的關(guān)鍵基因。隨后將這個(gè)25個(gè)基因?qū)氲絎ebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選與骨肉瘤相關(guān)的通路，將通路中的基因?qū)際CMDB數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)了4個(gè)靶基因：CXCL8,CXCL12,LPAR1,CNR1。最后預(yù)測(cè)4個(gè)靶基因的miRNA并進(jìn)行驗(yàn)證，得到4個(gè)miRNA：hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p，hsa-miR-200a-3p。

以上4個(gè)靶基因都與骨肉瘤之間有關(guān)，前期研究報(bào)道了CXCL8通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K / Akt信號(hào)通路促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]；而 CXCL12/ CXCR4軸在骨肉瘤原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中存在重要的作用，特別是肺轉(zhuǎn)移[15]。研究發(fā)現(xiàn)單?；视椭久敢种苿㎎ZL184可以抑制骨肉瘤所造成的骨溶解現(xiàn)象，可能是通過(guò)調(diào)控CNR1進(jìn)行的[16]。而用順鉑處理后的骨肉瘤MG63細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)LPAR1的表達(dá)明顯減低，證實(shí)LAPR1也和骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[17]。miR-23b-3p可以通過(guò)抑制PGC1α從而促進(jìn)骨肉瘤增殖從[18]；miR-141-3p是骨肉瘤中 EGFR通路的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，影響骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展[19]；另外兩種miRNA雖與骨肉瘤無(wú)直接相關(guān)，但這兩種miRNA在骨肉瘤中表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且兩種miRNA可調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展[20-21]。因此，以上分析中所得到的4個(gè)靶基因和4個(gè)miRNA都與骨腫瘤有著聯(lián)系，可以作為骨肉瘤潛在的靶基因。為以后對(duì)骨肉瘤的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為染料木素治療骨肉瘤增加了靶基因并且提供了理論支持。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)染料木素中11個(gè)靶基因有關(guān)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,探討染料木素對(duì)骨肉瘤潛在的作用靶基因。運(yùn)用STRING、WebGestalt，cytoscape和HCDMB以及miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CXCL8,CXCL12,LPAR1,CNR1以及hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p，hsa-miR-200a-3p基因可能是骨肉瘤的潛在靶基因。不僅能促進(jìn)骨肉瘤研究的進(jìn)展，也可以老藥新用，提供新的藥物治療靶點(diǎn)，進(jìn)而擴(kuò)大藥物的適用范圍。