米曉鈺，李 喬，馬 睿，朱曉林，溫永強(qiáng)，劉 霞*，杜曉華

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

腦紅蛋白(Neuroglobin，NGB)是德國科學(xué)家Burmester于2000年首次發(fā)現(xiàn)的一種特異性攜氧球蛋白，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1]。與血紅蛋白、肌紅蛋白相比，NGB具有經(jīng)典螺旋三折疊結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，其基本結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)肽鏈和 1 個(gè)血紅蛋白[2]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是生物長期演化出的結(jié)果，從 DNA 編碼轉(zhuǎn)錄翻譯到蛋白質(zhì)序列折疊形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，并非一個(gè)隨機(jī)產(chǎn)生的過程。對任意蛋白質(zhì)的序列進(jìn)行修改，即使只增加、刪除或修改蛋白質(zhì)序列中的一個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)都會發(fā)生明顯的改變，相應(yīng)的蛋白質(zhì)功能也會隨之變化，而如果修改兩個(gè)及以上氨基酸，多數(shù)蛋白將無法進(jìn)行有效的折疊[3]。要想深入探究蛋白質(zhì)的內(nèi)部功能機(jī)制，則首先需要證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與其功能之間的關(guān)系。近年來，國內(nèi)外學(xué)者主要對NGB轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及其在神經(jīng)元中的保護(hù)作用開展了相關(guān)研究工作[4-7]，至于NGB蛋白結(jié)構(gòu)學(xué)方面的研究，則多集中于對其基本結(jié)構(gòu)[8]及功能相關(guān)核心位點(diǎn)的研究[9-10]，國內(nèi)目前對于該項(xiàng)工作的研究尚處于生物信息學(xué)的初步分析階段[11]，而針對NGB蛋白三級結(jié)構(gòu)的詳細(xì)預(yù)測分析還未見相關(guān)報(bào)道。本項(xiàng)目組李盛杰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，天祝白牦牛NGB基因編碼的氨基酸序列與普通黃牛相比，在第83、97位分別發(fā)生了絲氨酸(Ser)→脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)→谷氨酰胺(Gln)的突變，但其生物學(xué)意義目前尚不明確。針對天祝白牦牛NGB蛋白兩處氨基酸位點(diǎn)突變，本文擬從蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型分析突變造成的NGB蛋白結(jié)構(gòu)變化，并與黃牛NGB蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，推測天祝白牦牛NGB蛋白位點(diǎn)突變對其三級結(jié)構(gòu)的影響，為進(jìn)一步探究高原低氧環(huán)境下牦牛NGB蛋白的遺傳特性和生理機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 NGB蛋白同源性比較分析

登陸Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)下載天祝白牦牛、黃牛、甘南牦牛、綿羊、獼猴、人類、紅原雞等25個(gè)物種的NGB氨基酸序列(登錄信息見表1所示)。利用Clustal-Raindy、MEGA等軟件對25個(gè)物種NGB蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2 NGB蛋白三級結(jié)構(gòu)比較分析

利用Swiss Model(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線軟件對天祝白牦牛、黃牛NGB蛋白進(jìn)行三維建模，并用Spdbv軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)模型輸出。

2 結(jié)果分析

2.1 天祝白牦牛NGB蛋白同源性

研究結(jié)果顯示(見圖1)，天祝白牦牛NGB蛋白151個(gè)氨基酸殘基中，65個(gè)氨基酸殘基為保守序列，26個(gè)氨基酸殘基為保守替換，9個(gè)氨基酸殘基為半保守替換，51個(gè)氨基酸殘基為未知突變。其中，與NGB蛋白功能相關(guān)核心His 64、His 96在進(jìn)化中為保守序列，Cys 46為未知突變，Cys 55為保守序列；天祝白牦牛兩處突變氨基酸， 83號位點(diǎn)在進(jìn)化中為未知突變；97號位點(diǎn)為保守替換。

2.2 天祝白牦牛NGB蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化

不同物種NGB蛋白的聚類關(guān)系主要分為四大簇，分別為哺乳綱簇、兩棲綱簇、鳥綱簇和魚綱簇，且進(jìn)化趨于保守(見圖 2)。哺乳綱簇中，天祝白牦牛NGB與甘南牦牛、黃牛、印度水牛、綿羊等?？苿游锏挠H緣關(guān)系最近，分支支持率為100%；與白犀牛、穴兔、貂熊、黑猩猩、人類、小鼠等物種的親緣關(guān)系次之，分支支持率大于50%；與鼠狐猴、雙峰駝等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分支支持率小于50%。兩棲綱簇以熱帶爪蟾單獨(dú)聚為一分支，鳥綱簇以紅原雞單獨(dú)聚為一分支，魚綱簇以虹鱒魚、斑馬魚、河豚單獨(dú)聚為一分支，均與天祝白牦牛NGB親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表1 不同物種NGB蛋白序列信息Table 1 Sequence information of NGB protein in different species

2.3 天祝白牦牛NGB蛋白三級結(jié)構(gòu)

2.3.1 NGB蛋白基本結(jié)構(gòu)

分別利用天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白在Swiss Model中的不同輸出模板，用Spdbv軟件對兩物種NGB蛋白進(jìn)行同源建模，得到天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白基本結(jié)構(gòu)，如圖3所示。天祝白牦牛與普通黃牛NGB蛋白為血紅素蛋白，金屬蛋白亞類，卟啉環(huán)中心含一個(gè)鐵原子，該原子在軸兩極等距的中緯線上與卟啉環(huán)上的四個(gè)氮原子以及近端His 96協(xié)調(diào)配位；在還原狀態(tài)下，His 64上的一個(gè)氮原子與中心鐵原子配位，形成雙組氨酸六配位結(jié)構(gòu)(見圖3A、3B)。其中，天祝白牦牛近端His 96與中心鐵原子距離為2.00 ?，遠(yuǎn)端His 64 與中心鐵原子距離為2.10 ?；黃牛近端His 96與中心鐵原子距離為1.98 ?，遠(yuǎn)端His 64與中心鐵原子距離為2.17 ?。天祝白牦牛與普通黃牛NGB蛋白三級結(jié)構(gòu)主要是由8個(gè)α-螺旋構(gòu)成的蛋白質(zhì)多肽，α-螺旋之間的拐彎由1～8個(gè)殘基構(gòu)成無規(guī)卷曲，其中A，B，E，F(xiàn)，G，H α-螺旋被組裝成兩層結(jié)構(gòu)，肽鏈盤繞成球形把血紅素分子緊密包裹其中；分子內(nèi)部幾乎全部為疏水性R側(cè)鏈，分子外表面則包括疏水性和親水性氨基酸殘基，絕大多數(shù)親水性R側(cè)鏈在分子外表面，使NGB蛋白為可溶于水的蛋白質(zhì)(見圖3C、3D、3E、3F)。

2.3.2 NGB蛋白與功能相關(guān)核心結(jié)構(gòu)

NGB蛋白與功能相關(guān)核心結(jié)構(gòu)有：血紅素“漏斗”結(jié)構(gòu)，腔/隧道結(jié)構(gòu)以及CD環(huán)結(jié)構(gòu)。

血紅素“漏斗”結(jié)構(gòu)：如圖4A-F所示，NGB蛋白Phe 28，Phe 42、Tyr 44、Lys 67、Val 68構(gòu)成疏水腔體[13-15]，形似“漏斗”，落在血紅素縫隙外，通過與血紅素丙酸鹽的靜電作用，參與維持血紅素穩(wěn)定，天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白Tyr 44空間取向存在差異(見圖4A、4B、4D、4E)，黃牛Tyr 44氧原子指向卟啉環(huán)中心。

圖3 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白基本結(jié)構(gòu)Fig.3 Basic NGB protein structure of Tianzhu white yak and cattle

腔/隧道結(jié)構(gòu)：如圖4G-L所示，NGB腔/隧道結(jié)構(gòu)包括Val 71，Ile 72，Val 109，Leu 113，Leu 136和Val 140[8]，該結(jié)構(gòu)在天祝白牦牛和黃牛基本一致。

CD環(huán)結(jié)構(gòu)：天祝白牦牛Cys 46-Cys 55形成二硫鍵(見圖4M)，而黃牛Cys 46、Cys 55未形成二硫鍵，鍵距為18.79 ?(見圖4N)。

圖4 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白與功能相關(guān)核心結(jié)構(gòu)Fig.4 Function-related core structure of NGB protein in Tianzhu white yak and cattle

2.4 天祝白牦牛NGB蛋白突變相關(guān)結(jié)構(gòu)

對編碼NGB蛋白突變位點(diǎn)氨基酸的密碼子進(jìn)行分析，天祝白牦牛NGB蛋白83號位點(diǎn)原Ser密碼子分別為UCU、UCC、UCA、UCG，經(jīng)突變后Pro密碼子分別為CCU、CCC、CCA、CCG，主要為1號位U突變?yōu)镃；97號位點(diǎn)原Arg密碼子分別為CGA、CGG，經(jīng)突變后Gln密碼子分別為CAA、CAG，主要為2號位G突變?yōu)锳。

對NGB蛋白突變位點(diǎn)氨基酸殘基的分布特征進(jìn)行分析，結(jié)果列于表2，3及圖5。由表2可知，天祝白牦牛和黃牛NGB蛋白突變位點(diǎn)的氨基酸殘基中Ser，Pro，Arg，Gln構(gòu)成α-螺旋和無規(guī)卷曲占比不同，在天祝白牦牛中構(gòu)成α-螺旋分別占：4.6%，2.7%，3.9%，2.7%；在黃牛中分別占：5.3%，2.7%，4.6%，1.9%；在天祝白牦牛中構(gòu)成無規(guī)卷曲分別占：4.6%，3.9%，1.9%，1.3%；在黃牛中分別占：4.6%，3.3%，1.9%，1.3%。

表2 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白突變位點(diǎn)氨基酸殘基組成Table 2 Composition of amino acid residues at the mutation sites of NGB protein in Tianzhu white yak and cattle

表3 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白Ser、Pro、Arg及Gln分布位點(diǎn)比較Table 3 Comparison of Ser, Pro, Arg, and Gln sites of NGB protein between Tianzhu white yak and cattle

由表3和圖5結(jié)果可知，天祝白牦牛NGB蛋白Ser多位于α-螺旋的端位，且突變前有4個(gè)位點(diǎn)相鄰(50、51，57、58，83、84，104、105)，醇羥基氧原子指向親水相(圖5B、5F)；NGB蛋白Pro多位于無規(guī)卷曲，在第20，52，59，83位點(diǎn)與Ser 19，51，58，84位點(diǎn)相鄰，四碳環(huán)指向疏水相(圖5D、5H)；Arg、Gln多位于α-螺旋的中間位，R側(cè)鏈氨基端指向親水相，羧基端參與構(gòu)成α-螺旋；Arg第10、47位與Gln第11、48位相鄰(圖5J、5N、5L、5P)。

重合天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)重合度較高，但CD環(huán)形態(tài)(見圖6A，黃色圓圈圈出結(jié)構(gòu))存在一定差異；天祝白牦牛83號位點(diǎn)為無規(guī)卷曲，黃牛83號位點(diǎn)為α-螺旋(見圖6B、6C)，97號位點(diǎn)二者均為α-螺旋(見圖6B、6D)。其中，NGB蛋白Ser突變?yōu)镻ro主要為R側(cè)鏈由醇羥基突變?yōu)樗奶辑h(huán)，側(cè)鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(見圖6E、6G)；突變位于E、F鏈之間，對使得E、F鏈之間的間距由11.79?變?yōu)?.21?(見圖6F、6H)；Arg突變?yōu)镚ln主要為R側(cè)鏈由氮原子突變?yōu)檠踉?，且與碳原子通過雙鍵連接，側(cè)鏈結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變 (見圖6I、6K)；97號位點(diǎn)突變基團(tuán)指向親水相，羧基端與96號位點(diǎn)相連，對96號位點(diǎn)取向造成影響(見圖6J、6L)。

圖5 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白Ser、Pro、Arg及Gln分布特征比較Fig.5 Comparison of distribution characteristics of Ser, Pro, Arg and Gln of NGB protein in Tianzhu white yak and cattle

圖6 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白突變位點(diǎn)結(jié)構(gòu)比較Fig.6 Comparison of mutation site structures of NGB protein in Tianzhu white yak and cattle

3 討論與結(jié)論

對NGB蛋白的同源序列比較發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物NGB蛋白中，天祝白牦牛是唯一出現(xiàn)83號位點(diǎn)突變的物種，分析其可能的原因是機(jī)體在長期適應(yīng)高寒低氧環(huán)境過程中產(chǎn)生了DNA自發(fā)性損傷，編碼氨基酸的密碼子發(fā)生突變，進(jìn)而導(dǎo)致氨基酸種類由Ser突變?yōu)榱薖ro。比較天祝白牦牛和黃牛NGB蛋白Ser和Pro三級結(jié)構(gòu)的分布特征發(fā)現(xiàn)，天祝白牦牛NGB蛋白83號位點(diǎn)Pro偏向于形成無規(guī)卷曲(3.9%)，而無規(guī)卷曲對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和柔韌性均會產(chǎn)生影響[16]，因此該突變很可能會對天祝白牦牛NGB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和柔韌性帶來一定程度的改變。此外，有研究發(fā)現(xiàn)Ser具有不帶電荷的極性側(cè)鏈(β羥基)，有親水性，并易被酯化和糖基化；Pro為疏水氨基酸，且與其它標(biāo)準(zhǔn)氨基酸在結(jié)構(gòu)上有很大不同(α亞氨基酸)，具有環(huán)化的側(cè)鏈，該側(cè)鏈對蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)有很大制約[17]，因此，Ser突變形成Pro，對NGB蛋白質(zhì)溶解度可能會產(chǎn)生一定影響。不過，上述83號突變位點(diǎn)對NGB蛋白產(chǎn)生的一系列影響是否會進(jìn)一步帶來功能上的變化仍需更深入的研究探討。

本研究結(jié)果顯示，在還原狀態(tài)下，天祝白牦牛 NGB 蛋白可形成雙組氨酸六配位結(jié)構(gòu)，Liu等[18]及 Hota等[19]研究認(rèn)為在正常生理?xiàng)l件下， NGB 約占細(xì)胞總濃度的 30%，在低氧條件下，許多神經(jīng)保護(hù)性低氧誘導(dǎo)型基因(如低氧誘導(dǎo)因子-1α，血管內(nèi)皮生長因子，血紅素加氧酶-1和促紅細(xì)胞生成素)上調(diào)以協(xié)助促進(jìn)細(xì)胞存活，這使得 NGB 濃度迅速上升到原濃度的 80%，且這種上升發(fā)生在數(shù)秒之間，說明NGB蛋白在還原狀態(tài)下大量穩(wěn)定存在有利于機(jī)體適應(yīng)高原低氧環(huán)境，而83號位點(diǎn)突變造成了E、F鏈距離變窄，致使核心His 64與卟啉環(huán)中心距離變短(由2.17?變?yōu)?.10?)，使還原狀態(tài)下天祝白牦牛NGB蛋白結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，這可能是NGB蛋白在牦牛適應(yīng)高原低氧環(huán)境中發(fā)揮作用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。有研究報(bào)道顯示，NGB蛋白與外源性配體如O2、CO、NO 等發(fā)生結(jié)合時(shí)，首先要打破鐵和遠(yuǎn)端His 64之間的紐帶，而后外源性配體才有可能與NGB結(jié)合，外源性配體與內(nèi)源性遠(yuǎn)端His 64之間的競爭導(dǎo)致了配體結(jié)合動力學(xué)的復(fù)雜模式[20]，因此His 64位點(diǎn)與卟啉環(huán)中心距離的改變極有可能對血紅素外源配體的結(jié)合產(chǎn)生一定的影響。由此，83號位點(diǎn)突變很有可能是天祝白牦牛適應(yīng)高寒低氧環(huán)境所必須的，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可繼續(xù)針對天祝白牦牛該突變位點(diǎn)與NGB蛋白配體結(jié)合能力之間的聯(lián)系開展相應(yīng)研究工作。

與83號位點(diǎn)相比較，天祝白牦牛NGB蛋白97號位點(diǎn)的突變是保守替換，雖然導(dǎo)致了氨基酸種類發(fā)生改變，但對NGB蛋白結(jié)構(gòu)并未產(chǎn)生影響，不過研究顯示Arg等電點(diǎn)為10.76，而Gln等電點(diǎn)為5.65[17]，差異較大，提示該位點(diǎn)突變也會對NGB蛋白的溶解度產(chǎn)生一定影響。此外，97號位點(diǎn)突變使核心His 96與卟啉環(huán)中心距離由1.98 ?變?yōu)?.00 ?，說明該突變對96號位點(diǎn)的向心取向會造成一定改變，由于His 96是整個(gè)NGB蛋白最核心的位點(diǎn)，決定著NGB蛋白的活性[21]，因此向心取向的變化可能會對NGB蛋白功能的發(fā)揮造成影響，究其具體影響范圍和機(jī)制尚有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。總體而言，97號位點(diǎn)突變雖然對蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)不造成影響，卻改變了蛋白核心位點(diǎn)的向心取向，同時(shí)對蛋白質(zhì)溶解度也造成了一定影響，此外，與天祝白牦牛親緣關(guān)系最近的甘南牦牛也存在97號位點(diǎn)的突變現(xiàn)象，對該位點(diǎn)突變的深入探究同樣具有十分重要的意義。

相較于黃牛，天祝白牦牛NGB蛋白兩處氨基酸突變對其血紅素“漏斗”結(jié)構(gòu)及腔/隧道結(jié)構(gòu)均未造成影響，說明兩結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中趨于保守，但CD 環(huán)結(jié)構(gòu)存在一定差異。研究表明，NGB 蛋白 CD 環(huán)上的 Cys 46、Cys 55 因其 R 基團(tuán)具有-SH，因此可在空間形成二硫鍵，Cys 46-Cys 55 鍵的形成可降低血紅素-Fe 原子的第六配位鍵的強(qiáng)度，促進(jìn)配體結(jié)合；相反，Cys 46-Cys 55 鍵的裂解可穩(wěn)定血紅素-Fe 原子的六配位鍵并損害金屬中心的反應(yīng)性[22-25]，天祝白牦牛 Cys 46-Cys 55 鍵為結(jié)合狀 態(tài)，而黃牛為斷裂狀態(tài)(鍵距：18.79?)，說明天祝白牦牛 NGB 蛋白配體結(jié)合能力更強(qiáng)，鑒于目前有大量NGB蛋白結(jié)構(gòu)學(xué)研究集中在對其CD 環(huán)結(jié)構(gòu)的研究上[9,10,23,24]，也進(jìn)一步印證了其重要性，天祝白牦牛相較于黃牛CD 環(huán)結(jié)構(gòu)的差異是否與兩處突變位點(diǎn)有關(guān)聯(lián)仍有待更進(jìn)一步的分析驗(yàn)證。