吳托雅 石金 郭繼東 劉原園 逄宇 魯潔 高飛

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)可通過(guò)免疫逃逸促進(jìn)其自身胞內(nèi)存活，導(dǎo)致疾病的遷延不愈[1-2]。因此，探究MTB與宿主細(xì)胞的關(guān)系，對(duì)于深入闡明其致病機(jī)制及宿主的抗結(jié)核免疫具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼核糖核酸，通過(guò)與靶基因的調(diào)控區(qū)域結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平降解mRNA或抑制靶基因的翻譯，作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后阻遏物參與許多生理和病理反應(yīng)[3-4]。最近的研究已經(jīng)確立了miRNA在免疫調(diào)節(jié)中的新作用，包括調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的發(fā)育和分化、抗體的產(chǎn)生及先天免疫等過(guò)程[5-6]。miRNA的異常表達(dá)也與各種腫瘤疾病相關(guān)[7]。研究顯示，microRNA-21-3p(簡(jiǎn)稱“miR-21-3p”)對(duì)腫瘤耐藥、組織損傷、甲型流感病毒復(fù)制等具有調(diào)控作用[8-13]。然而，miR-21-3p對(duì)MTB感染的調(diào)控機(jī)制研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，筆者通過(guò)原代巨噬細(xì)胞及細(xì)胞模型探究miR-21-3p在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)對(duì)抗MTB感染中的作用。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.材料來(lái)源：研究所用的細(xì)胞系THP-1和U937，以及MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv均來(lái)自北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所生物資源樣本庫(kù)。

2.培養(yǎng)基：分枝桿菌羅氏中性培養(yǎng)基(批號(hào)：2012081)購(gòu)自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司；OADC增菌液(9017941)和7H10固體培養(yǎng)基(批號(hào)：0126928)購(gòu)自美國(guó)BD公司；1640含酚紅培養(yǎng)液(批號(hào)：29420003)購(gòu)自美國(guó)Corning公司；胎牛血清(批號(hào)：2021472)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

3.試劑：細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒(批號(hào)：R1061)購(gòu)自廣州東勝生物科技有限公司；miDETECT A Track miRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒(批號(hào)：T0909)、miR-21-3p上游引物(批號(hào)：00417)及U6上游引物(批號(hào)：R0529)均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(批號(hào)：H0901211)及Hief?qPCR SYBR?Green Master Mix(No Rox)(批號(hào)：H9001130)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；CCK-8試劑盒(細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒)(批號(hào)：20150715)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。TBD人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液(批號(hào)：LDS1075)及TBD清洗液(批號(hào)：2010X1118)購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限公司。

4.引物信息：使用Primer Premier 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行引物合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR引物信息

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：人巨噬細(xì)胞系THP-1和U937接種于含有10%胎牛血清的1640含酚紅培養(yǎng)液，在含5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分離：抽取6例臨床確診肺結(jié)核患者及6名健康人的外周血，5 ml/例。收集外周全血，加入TBD人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液，450×g離心25 min，吸取乳白色環(huán)狀細(xì)胞層，加入TBD清洗液，250×g離心10 min，洗滌細(xì)胞2次后計(jì)數(shù)并收集細(xì)胞。

3.細(xì)胞感染：MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv接種于分枝桿菌羅氏中性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3周后，研磨成單一的細(xì)菌懸浮液。將THP-1和U937細(xì)胞計(jì)數(shù)并接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)以50 ng/ml的濃度誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化。24 h后用1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌平板2次，并以相同感染復(fù)數(shù)(MOI=5)的MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv感染細(xì)胞，在含5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并在指定的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：為了上調(diào)或下調(diào)U937和THP-1細(xì)胞中miR-21-3p的表達(dá)，應(yīng)用購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司的miR-21-3p模擬物(mimic)及陰性對(duì)照(negative control mimic，NC-mimic)、抑制劑(inhibitor)及陰性對(duì)照(negative control inhibitor，NC-inhibitor)轉(zhuǎn)染到U937和THP-1細(xì)胞中，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)分析以評(píng)估轉(zhuǎn)染效果。

5.qRT-PCR：用細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒抽提細(xì)胞總RNA；用miDETECT A Track miRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒進(jìn)行mRNA cDNA合成，并對(duì)miR-21-3p的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以U6作為內(nèi)部對(duì)照。以試劑盒Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以Hief?qPCR SYBR?Green Master Mix(No Rox)試劑盒對(duì)炎癥細(xì)胞因子及候選靶基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作內(nèi)部對(duì)照。采用2-△△Ct(Livak)方法，以對(duì)照基因作為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。

6.細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)：將細(xì)胞計(jì)數(shù)并接種到96孔板中，分別用模擬物、抑制劑或其陰性對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在指定的時(shí)間點(diǎn)將10 μl CCK-8(cell counting kit-8)試劑加入96孔板中，并在37 ℃下再孵育4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度(A)值。

7.菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)計(jì)數(shù)法：細(xì)胞在感染MTB后用PBS洗滌細(xì)胞2次以去除胞外細(xì)菌，并在新鮮培養(yǎng)基中孵育至指定的時(shí)間點(diǎn)。用0.05% SDS裂解感染的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)10倍梯度稀釋，按照稀釋比例接種在含有10% OADC的7H10瓊脂平板上，并在37 ℃孵育3～4周，計(jì)算CFU。

8.潛在靶基因篩選：使用TargetScan、miRDB和DIANA等miRNA靶基因預(yù)測(cè)生物信息學(xué)工具檢測(cè)與miR-21-3p序列匹配的基因。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行分析。偏態(tài)分布的計(jì)量資料以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”表示，兩組間差異的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間差異的比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MTB感染誘導(dǎo)宿主巨噬細(xì)胞中miR-21-3p表達(dá)上調(diào)

對(duì)6例臨床肺結(jié)核患者及6名健康人的外周血PBMC的檢測(cè)結(jié)果表明，結(jié)核病組PBMC的miR-21-3p相對(duì)表達(dá)量為7.286(6.964，10.483)，明顯高于健康對(duì)照組的1.030(0.997，1.169)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U<0.001，P=0.002)。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在感染MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv 24 h后，細(xì)胞系THP-1及U937中的miR-21-3p相對(duì)表達(dá)量分別為16.311(15.543，17.030)和72.850(65.343，97.343)，與感染前(即0 h組)[1.038(0.959，1.165)與1.029(0.979，1.200)]相比均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U值均<0.001，P值均為0.002)。

二、miR-21-3p抑制MTB在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活

應(yīng)用miR-21-3p模擬物(mimic)及其陰性對(duì)照(NC-mimic)、抑制劑(inhibitor)及陰性對(duì)照(NC-inhibitor)，分別轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞，結(jié)果表明，miR-21-3p模擬物組miR-21-3p相對(duì)表達(dá)量為256.351(187.079，448.045)，高于NC-mimic組的0.987(0.426，1.026)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U<0.001，P=0.002)。而抑制劑組miR-21-3p相對(duì)表達(dá)量為0.030(0.027，0.054)，明顯低于NC-inhibitor組的0.987(0.875，1.026)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U<0.001，P=0.002)。

為了確定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21-3p模擬物和抑制劑后是否會(huì)對(duì)巨噬細(xì)胞活性產(chǎn)生影響，采用CCK-8分析法檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下的細(xì)胞活性，結(jié)果顯示，miR-21-3p模擬物組、NC-mimic組、抑制劑組、NC-inhibitor 組A值分別為2.056(2.028，2.349)、2.137(1.984，2.181)、2.076(1.835,2.253)、1.896(1.674，2.174)，各轉(zhuǎn)染處理組間的細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=1.647，P=0.649)，細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

以MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv感染miRNA轉(zhuǎn)染成功的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，用CFU計(jì)數(shù)法測(cè)定巨噬細(xì)胞中MTB菌量。結(jié)果顯示，在感染后24 h miR-21-3p模擬物組的胞內(nèi)菌量為7.5×104(6.0×104，8.8×104)，明顯少于NC-mimic組的13.5×104(12.0×104，14.0×104)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U<0.001，P=0.002)。

三、miR-21-3p促進(jìn)MTB感染巨噬細(xì)胞過(guò)程中炎癥因子的表達(dá)

巨噬細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染miR-21-3p后，以MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv進(jìn)行感染并檢測(cè)炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平。結(jié)果顯示，與NC-mimic組相比，miR-21-3p模擬物組的巨噬細(xì)胞對(duì)于MTB感染導(dǎo)致的炎癥應(yīng)答明顯增強(qiáng)，IL-6及TNF-α的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別由1.803(1.729，1.892)及0.960(0.858，1.020)升高至4.520(4.234，5.205)及1.455(1.372，1.523)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U值均<0.001，P值均為0.002)。而抑制劑組的IL-6及TNF-α相對(duì)表達(dá)量分別為0.927(0.901，1.050)及0.781(0.705，0.805)，較NC-inhibitor組的1.819(1.007，1.953)及1.101(0.994，1.202)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=2.000，P=0.009；U<0.001，P=0.002)。

四、miR-21-3p潛在靶基因分析

通過(guò)TargetScan、miRDB和DIANA預(yù)測(cè)與miR-21-3p序列匹配的基因，最終得到22個(gè)共有基因。經(jīng)過(guò)對(duì)文獻(xiàn)資料的搜索，最終篩選出與細(xì)胞增殖、凋亡及免疫過(guò)程相關(guān)的6個(gè)候選基因。巨噬細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染miR-21-3p后，以MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv進(jìn)行感染并檢測(cè)上述基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-21-3p模擬物組CDK-8的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于NC-mimic組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抑制劑組CDK-8的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于NC-inhibitor 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-21-3p模擬物組UBE4B的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于NC-mimic組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抑制劑組UBE4B的mRNA相對(duì)表達(dá)量，明顯高于NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-21-3p模擬物組PEG3的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于NC-mimic組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抑制劑組PEG3的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-21-3p模擬物組NFYB的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于NC-mimic組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抑制劑組NFYB的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-21-3p模擬物組KLHL3的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于NC-mimic組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抑制劑組KLHL3的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見(jiàn)表2。

表2 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv感染分組轉(zhuǎn)染miR-21-3p的巨噬細(xì)胞后潛在靶基因mRNA表達(dá)情況

討 論

近年來(lái)，miRNA在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的調(diào)節(jié)功能越來(lái)越受到研究者的重視。目前已有大量的研究證實(shí)，miR-21-3p作為一種重要的調(diào)節(jié)因子，在多種疾病中表現(xiàn)出不同的調(diào)控機(jī)制。筆者以MTB感染巨噬細(xì)胞為模型，探討了miR-21-3p在MTB感染過(guò)程中發(fā)揮的作用及相關(guān)機(jī)制。通過(guò)對(duì)臨床標(biāo)本檢測(cè)和細(xì)胞系感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-21-3p在MTB感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)。隨后，miRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p上調(diào)可以抑制MTB在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。對(duì)炎癥因子的檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-21-3p的巨噬細(xì)胞對(duì)于MTB感染導(dǎo)致的炎癥應(yīng)答明顯增強(qiáng)，TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平明顯增高。miRNA通過(guò)與其靶基因3′非翻譯(3′-UTR)區(qū)的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合來(lái)發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，并抑制靶基因的表達(dá)，說(shuō)明miRNA與其靶基因?yàn)樨?fù)向調(diào)節(jié)關(guān)系[14]。對(duì)靶基因的篩選和檢測(cè)結(jié)果表明，CDK-8可能是miR-21-3p對(duì)抗MTB感染過(guò)程中的潛在靶標(biāo)之一。

miRNA在MTB感染巨噬細(xì)胞的免疫過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。MTB感染可引起miR-33和miR-33*上調(diào)。miR-33和miR-33*可以抑制自噬和增加細(xì)胞脂質(zhì)儲(chǔ)存，以此來(lái)促進(jìn)MTB胞內(nèi)存活和擴(kuò)增[15]。MTB感染使miR-144*增多，miR-144*使DNA損傷調(diào)節(jié)的自噬調(diào)節(jié)劑2(DNA damage regulated autophagy modulator 2，DRAM2)和吞噬體表達(dá)降低，從而抑制細(xì)胞的自噬反應(yīng)[16]。miR-27a可通過(guò)下調(diào)Ca2+信號(hào)通路，抑制自噬體形成來(lái)促進(jìn)MTB胞內(nèi)存活[17]。miR-30a可明顯抑制MTB感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)[18-19]。miR-155、miR-365可抑制促炎因子TNF-α和IL-6的釋放，促進(jìn)MTB的胞內(nèi)存活；而miR-125和miR-32-5p則可促進(jìn)TNF-α和IL-6 表達(dá)[20]。

巨噬細(xì)胞作為MTB感染的直接宿主，可通過(guò)激活Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)誘導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。TLR在識(shí)別MTB配體后導(dǎo)致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1和IL-6。細(xì)胞因子通過(guò)結(jié)合特定的細(xì)胞表面受體作用于免疫細(xì)胞，引發(fā)復(fù)雜的細(xì)胞反應(yīng)[21-22]。TLR信號(hào)主要依賴于4種銜接蛋白：髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、Toll-白細(xì)胞介素1受體結(jié)構(gòu)域連接蛋白(Toll-interleukin 1 receptor domain-containing adaptor protein，TIRAP)、Toll樣受體銜接分子1(Toll-like receptor adaptor molecule 1，TICAM1)和TICAM2。它們直接結(jié)合激活的TLR并募集下游信號(hào)成分。除了僅通過(guò)TICAM1信號(hào)的TLR3，所有TLR都利用MyD88依賴性途徑，導(dǎo)致產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6和其他依賴于NF-κB的細(xì)胞因子[22]。miRNA可通過(guò)靶向TLR銜接蛋白來(lái)調(diào)節(jié)TLR誘導(dǎo)的NF-κB活化。例如，miR-30a直接靶向MyD88的3′-UTR，從而抑制巨噬細(xì)胞中TLR和MyD88活化及細(xì)胞因子表達(dá)[18]。miR-146a是一種抗炎miRNA，通過(guò)靶向白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK1)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)對(duì)NF-κB 的激活進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[23-24]。miR-27a則靶向TLR3銜接子TICAM1的3′-UTR，以減弱TLR3信號(hào)[25]。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶最初被描述為細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)劑，但后來(lái)證明它們?cè)诖x、神經(jīng)元分化、造血、血管生成等生物過(guò)程中具有多種作用[26]。與眾所周知的CDK家族成員不同，CDK-8不介導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程。CDK-8的一個(gè)關(guān)鍵功能是磷酸化RNA Pol Ⅱ的C末端結(jié)構(gòu)域(CTD)，使轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)[27]。CDK-8可以抑制和激活哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)錄[26]，正向調(diào)節(jié)幾種癌癥相關(guān)的信號(hào)通路，包括血清反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、缺氧誘導(dǎo)因子1α和雌激素受體[28]。另外，在幾種上皮來(lái)源的細(xì)胞系和髓樣細(xì)胞中，CDK-8及其平行激酶CDK-19共同參與TLR-9的轉(zhuǎn)錄激活并與C/EBPβ和NF-κB共同調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[27，29]。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了miR-21-3p可以促進(jìn)MTB感染誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α和IL-6，并篩選出CDK-8為其在MTB感染中可能的靶基因。筆者推測(cè)miR-21-3p在MTB感染宿主巨噬細(xì)胞的過(guò)程中，通過(guò)靶向調(diào)控CDK-8來(lái)調(diào)節(jié)TLR介導(dǎo)的炎癥通路。后續(xù)可以通過(guò)更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)這一假設(shè)。可以肯定的是，miR-21-3p在MTB感染宿主巨噬細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)或可能有助于開(kāi)發(fā)結(jié)核病的新治療方法，并提示miRNA和靶基因可作為針對(duì)結(jié)核病的宿主導(dǎo)向治療的潛在候選物。