吳托雅 石金 郭繼東 劉原園 逄宇 魯潔 高飛

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)可通過免疫逃逸促進其自身胞內存活，導致疾病的遷延不愈[1-2]。因此，探究MTB與宿主細胞的關系，對于深入闡明其致病機制及宿主的抗結核免疫具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種內源性非編碼核糖核酸，通過與靶基因的調控區(qū)域結合，在轉錄后水平降解mRNA或抑制靶基因的翻譯，作為基因表達的轉錄后阻遏物參與許多生理和病理反應[3-4]。最近的研究已經確立了miRNA在免疫調節(jié)中的新作用，包括調節(jié)免疫細胞的發(fā)育和分化、抗體的產生及先天免疫等過程[5-6]。miRNA的異常表達也與各種腫瘤疾病相關[7]。研究顯示，microRNA-21-3p(簡稱“miR-21-3p”)對腫瘤耐藥、組織損傷、甲型流感病毒復制等具有調控作用[8-13]。然而，miR-21-3p對MTB感染的調控機制研究目前尚未見報道。為此，筆者通過原代巨噬細胞及細胞模型探究miR-21-3p在宿主巨噬細胞內對抗MTB感染中的作用。

材料和方法

一、實驗材料

1.材料來源：研究所用的細胞系THP-1和U937，以及MTB標準株H37Rv均來自北京市結核病胸部腫瘤研究所生物資源樣本庫。

2.培養(yǎng)基：分枝桿菌羅氏中性培養(yǎng)基(批號：2012081)購自珠海市銀科醫(yī)學工程股份有限公司；OADC增菌液(9017941)和7H10固體培養(yǎng)基(批號：0126928)購自美國BD公司；1640含酚紅培養(yǎng)液(批號：29420003)購自美國Corning公司；胎牛血清(批號：2021472)購自美國Gibco公司。

3.試劑：細胞/細菌總RNA提取試劑盒(批號：R1061)購自廣州東勝生物科技有限公司；miDETECT A Track miRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒(批號：T0909)、miR-21-3p上游引物(批號：00417)及U6上游引物(批號：R0529)均購自廣州銳博生物技術有限公司；Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(批號：H0901211)及Hief?qPCR SYBR?Green Master Mix(No Rox)(批號：H9001130)購自上海翊圣生物科技有限公司；CCK-8試劑盒(細胞增殖及毒性檢測試劑盒)(批號：20150715)購自北京索萊寶科技有限公司。TBD人全血單個核細胞分離液(批號：LDS1075)及TBD清洗液(批號：2010X1118)購自天津市灝洋生物制品科技有限公司。

4.引物信息：使用Primer Premier 軟件進行引物設計，由北京擎科生物科技有限公司進行引物合成，引物序列見表1。

表1 熒光定量逆轉錄PCR引物信息

二、實驗方法

1.細胞培養(yǎng)：人巨噬細胞系THP-1和U937接種于含有10%胎牛血清的1640含酚紅培養(yǎng)液，在含5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分離：抽取6例臨床確診肺結核患者及6名健康人的外周血，5 ml/例。收集外周全血，加入TBD人全血單個核細胞分離液，450×g離心25 min，吸取乳白色環(huán)狀細胞層，加入TBD清洗液，250×g離心10 min，洗滌細胞2次后計數(shù)并收集細胞。

3.細胞感染：MTB標準株H37Rv接種于分枝桿菌羅氏中性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3周后，研磨成單一的細菌懸浮液。將THP-1和U937細胞計數(shù)并接種于6孔細胞培養(yǎng)板上，在細胞培養(yǎng)液中加入佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)以50 ng/ml的濃度誘導巨噬細胞分化。24 h后用1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌平板2次，并以相同感染復數(shù)(MOI=5)的MTB標準株H37Rv感染細胞，在含5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并在指定的時間點收集細胞。

4.細胞轉染：為了上調或下調U937和THP-1細胞中miR-21-3p的表達，應用購自廣州銳博生物科技有限公司的miR-21-3p模擬物(mimic)及陰性對照(negative control mimic，NC-mimic)、抑制劑(inhibitor)及陰性對照(negative control inhibitor，NC-inhibitor)轉染到U937和THP-1細胞中，采用實時熒光定量逆轉錄PCR(qRT-PCR)分析以評估轉染效果。

5.qRT-PCR：用細胞/細菌總RNA提取試劑盒抽提細胞總RNA；用miDETECT A Track miRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒進行mRNA cDNA合成，并對miR-21-3p的表達量進行qRT-PCR檢測，以U6作為內部對照。以試劑盒Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix進行逆轉錄合成cDNA后，以Hief?qPCR SYBR?Green Master Mix(No Rox)試劑盒對炎癥細胞因子及候選靶基因的mRNA表達量進行qRT-PCR檢測，以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作內部對照。采用2-△△Ct(Livak)方法，以對照基因作為標準，對目標基因的表達量進行相對定量。

6.細胞增殖及毒性檢測：將細胞計數(shù)并接種到96孔板中，分別用模擬物、抑制劑或其陰性對照進行轉染。在指定的時間點將10 μl CCK-8(cell counting kit-8)試劑加入96孔板中，并在37 ℃下再孵育4 h。使用酶標儀測量450 nm處的吸光度(A)值。

7.菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)計數(shù)法：細胞在感染MTB后用PBS洗滌細胞2次以去除胞外細菌，并在新鮮培養(yǎng)基中孵育至指定的時間點。用0.05% SDS裂解感染的細胞，經過10倍梯度稀釋，按照稀釋比例接種在含有10% OADC的7H10瓊脂平板上，并在37 ℃孵育3～4周，計算CFU。

8.潛在靶基因篩選：使用TargetScan、miRDB和DIANA等miRNA靶基因預測生物信息學工具檢測與miR-21-3p序列匹配的基因。

三、統(tǒng)計學處理

采用 GraphPad Prism 8軟件進行分析。偏態(tài)分布的計量資料以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”表示，兩組間差異的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間差異的比較采用Kruskal-WallisH檢驗，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、MTB感染誘導宿主巨噬細胞中miR-21-3p表達上調

對6例臨床肺結核患者及6名健康人的外周血PBMC的檢測結果表明，結核病組PBMC的miR-21-3p相對表達量為7.286(6.964，10.483)，明顯高于健康對照組的1.030(0.997，1.169)，差異有統(tǒng)計學意義(U<0.001，P=0.002)。

細胞實驗結果顯示，在感染MTB標準株H37Rv 24 h后，細胞系THP-1及U937中的miR-21-3p相對表達量分別為16.311(15.543，17.030)和72.850(65.343，97.343)，與感染前(即0 h組)[1.038(0.959，1.165)與1.029(0.979，1.200)]相比均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(U值均<0.001，P值均為0.002)。

二、miR-21-3p抑制MTB在巨噬細胞內的存活

應用miR-21-3p模擬物(mimic)及其陰性對照(NC-mimic)、抑制劑(inhibitor)及陰性對照(NC-inhibitor)，分別轉染U937細胞，結果表明，miR-21-3p模擬物組miR-21-3p相對表達量為256.351(187.079，448.045)，高于NC-mimic組的0.987(0.426，1.026)，差異有統(tǒng)計學意義(U<0.001，P=0.002)。而抑制劑組miR-21-3p相對表達量為0.030(0.027，0.054)，明顯低于NC-inhibitor組的0.987(0.875，1.026)，差異有統(tǒng)計學意義(U<0.001，P=0.002)。

為了確定瞬時轉染miR-21-3p模擬物和抑制劑后是否會對巨噬細胞活性產生影響，采用CCK-8分析法檢測不同處理條件下的細胞活性，結果顯示，miR-21-3p模擬物組、NC-mimic組、抑制劑組、NC-inhibitor 組A值分別為2.056(2.028，2.349)、2.137(1.984，2.181)、2.076(1.835,2.253)、1.896(1.674，2.174)，各轉染處理組間的細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(H=1.647，P=0.649)，細胞可用于后續(xù)實驗。

以MTB標準株H37Rv感染miRNA轉染成功的實驗組細胞，用CFU計數(shù)法測定巨噬細胞中MTB菌量。結果顯示，在感染后24 h miR-21-3p模擬物組的胞內菌量為7.5×104(6.0×104，8.8×104)，明顯少于NC-mimic組的13.5×104(12.0×104，14.0×104)，差異有統(tǒng)計學意義(U<0.001，P=0.002)。

三、miR-21-3p促進MTB感染巨噬細胞過程中炎癥因子的表達

巨噬細胞分組轉染miR-21-3p后，以MTB標準株H37Rv進行感染并檢測炎性細胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平。結果顯示，與NC-mimic組相比，miR-21-3p模擬物組的巨噬細胞對于MTB感染導致的炎癥應答明顯增強，IL-6及TNF-α的mRNA 相對表達量分別由1.803(1.729，1.892)及0.960(0.858，1.020)升高至4.520(4.234，5.205)及1.455(1.372，1.523)，差異均有統(tǒng)計學意義(U值均<0.001，P值均為0.002)。而抑制劑組的IL-6及TNF-α相對表達量分別為0.927(0.901，1.050)及0.781(0.705，0.805)，較NC-inhibitor組的1.819(1.007，1.953)及1.101(0.994，1.202)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(U=2.000，P=0.009；U<0.001，P=0.002)。

四、miR-21-3p潛在靶基因分析

通過TargetScan、miRDB和DIANA預測與miR-21-3p序列匹配的基因，最終得到22個共有基因。經過對文獻資料的搜索，最終篩選出與細胞增殖、凋亡及免疫過程相關的6個候選基因。巨噬細胞分組轉染miR-21-3p后，以MTB標準株H37Rv進行感染并檢測上述基因的表達情況。結果顯示，miR-21-3p模擬物組CDK-8的mRNA相對表達量明顯低于NC-mimic組，差異有統(tǒng)計學意義。抑制劑組CDK-8的mRNA相對表達量明顯高于NC-inhibitor 組，差異有統(tǒng)計學意義。miR-21-3p模擬物組UBE4B的mRNA相對表達量明顯高于NC-mimic組，差異有統(tǒng)計學意義。抑制劑組UBE4B的mRNA相對表達量，明顯高于NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計學意義。miR-21-3p模擬物組PEG3的mRNA相對表達量高于NC-mimic組，差異有統(tǒng)計學意義。抑制劑組PEG3的mRNA相對表達量高于NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計學意義。miR-21-3p模擬物組NFYB的mRNA相對表達量明顯高于NC-mimic組，差異有統(tǒng)計學意義。抑制劑組NFYB的mRNA相對表達量明顯高于NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計學意義。miR-21-3p模擬物組KLHL3的mRNA相對表達量明顯高于NC-mimic組，差異有統(tǒng)計學意義。抑制劑組KLHL3的mRNA相對表達量明顯高于NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計學意義。具體見表2。

表2 結核分枝桿菌標準株H37Rv感染分組轉染miR-21-3p的巨噬細胞后潛在靶基因mRNA表達情況

討 論

近年來，miRNA在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的調節(jié)功能越來越受到研究者的重視。目前已有大量的研究證實，miR-21-3p作為一種重要的調節(jié)因子，在多種疾病中表現(xiàn)出不同的調控機制。筆者以MTB感染巨噬細胞為模型，探討了miR-21-3p在MTB感染過程中發(fā)揮的作用及相關機制。通過對臨床標本檢測和細胞系感染實驗，發(fā)現(xiàn)miR-21-3p在MTB感染的巨噬細胞內表達上調。隨后，miRNA 轉染實驗發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p上調可以抑制MTB在巨噬細胞內的存活。對炎癥因子的檢測結果表明，過表達miR-21-3p的巨噬細胞對于MTB感染導致的炎癥應答明顯增強，TNF-α和IL-6的mRNA表達水平明顯增高。miRNA通過與其靶基因3′非翻譯(3′-UTR)區(qū)的互補位點結合來發(fā)揮其調節(jié)作用，并抑制靶基因的表達，說明miRNA與其靶基因為負向調節(jié)關系[14]。對靶基因的篩選和檢測結果表明，CDK-8可能是miR-21-3p對抗MTB感染過程中的潛在靶標之一。

miRNA在MTB感染巨噬細胞的免疫過程中起到重要的調控作用。MTB感染可引起miR-33和miR-33*上調。miR-33和miR-33*可以抑制自噬和增加細胞脂質儲存，以此來促進MTB胞內存活和擴增[15]。MTB感染使miR-144*增多，miR-144*使DNA損傷調節(jié)的自噬調節(jié)劑2(DNA damage regulated autophagy modulator 2，DRAM2)和吞噬體表達降低，從而抑制細胞的自噬反應[16]。miR-27a可通過下調Ca2+信號通路，抑制自噬體形成來促進MTB胞內存活[17]。miR-30a可明顯抑制MTB感染誘導的巨噬細胞中TNF-α、IL-6、IL-8的表達[18-19]。miR-155、miR-365可抑制促炎因子TNF-α和IL-6的釋放，促進MTB的胞內存活；而miR-125和miR-32-5p則可促進TNF-α和IL-6 表達[20]。

巨噬細胞作為MTB感染的直接宿主，可通過激活Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)誘導系統(tǒng)性炎癥反應。TLR在識別MTB配體后導致巨噬細胞產生炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1和IL-6。細胞因子通過結合特定的細胞表面受體作用于免疫細胞，引發(fā)復雜的細胞反應[21-22]。TLR信號主要依賴于4種銜接蛋白：髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、Toll-白細胞介素1受體結構域連接蛋白(Toll-interleukin 1 receptor domain-containing adaptor protein，TIRAP)、Toll樣受體銜接分子1(Toll-like receptor adaptor molecule 1，TICAM1)和TICAM2。它們直接結合激活的TLR并募集下游信號成分。除了僅通過TICAM1信號的TLR3，所有TLR都利用MyD88依賴性途徑，導致產生TNF-α、IL-1、IL-6和其他依賴于NF-κB的細胞因子[22]。miRNA可通過靶向TLR銜接蛋白來調節(jié)TLR誘導的NF-κB活化。例如，miR-30a直接靶向MyD88的3′-UTR，從而抑制巨噬細胞中TLR和MyD88活化及細胞因子表達[18]。miR-146a是一種抗炎miRNA，通過靶向白細胞介素-1受體相關激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK1)和腫瘤壞死因子受體相關因子(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)對NF-κB 的激活進行負調節(jié)[23-24]。miR-27a則靶向TLR3銜接子TICAM1的3′-UTR，以減弱TLR3信號[25]。

細胞周期蛋白依賴性激酶最初被描述為細胞周期進程的調節(jié)劑，但后來證明它們在代謝、神經元分化、造血、血管生成等生物過程中具有多種作用[26]。與眾所周知的CDK家族成員不同，CDK-8不介導細胞周期進程。CDK-8的一個關鍵功能是磷酸化RNA Pol Ⅱ的C末端結構域(CTD)，使轉錄延長[27]。CDK-8可以抑制和激活哺乳動物的基因轉錄[26]，正向調節(jié)幾種癌癥相關的信號通路，包括血清反應網絡、轉化生長因子β、缺氧誘導因子1α和雌激素受體[28]。另外，在幾種上皮來源的細胞系和髓樣細胞中，CDK-8及其平行激酶CDK-19共同參與TLR-9的轉錄激活并與C/EBPβ和NF-κB共同調節(jié)炎癥相關基因的轉錄[27，29]。

綜上所述，本研究驗證了miR-21-3p可以促進MTB感染誘導的促炎因子TNF-α和IL-6，并篩選出CDK-8為其在MTB感染中可能的靶基因。筆者推測miR-21-3p在MTB感染宿主巨噬細胞的過程中，通過靶向調控CDK-8來調節(jié)TLR介導的炎癥通路。后續(xù)可以通過更多的實驗來證實這一假設。可以肯定的是，miR-21-3p在MTB感染宿主巨噬細胞的過程中發(fā)揮著重要的生物學功能，這項發(fā)現(xiàn)或可能有助于開發(fā)結核病的新治療方法，并提示miRNA和靶基因可作為針對結核病的宿主導向治療的潛在候選物。