陳宏坤 張大森

先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung disease,HD)又稱為腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥，是一種常見的小兒先天性消化道畸形，其發(fā)病率為1/5 000，男女比例約4∶1，發(fā)病年齡主要集中在出生后幾個月[1]。目前HD的主要治療方法是手術，多數(shù)患者術后生存率和生活質(zhì)量均得到一定提高，但是部分患者術后會出現(xiàn)小腸結(jié)腸炎(Hirschsprung associated enterocolitis,HAEC)，據(jù)統(tǒng)計造成HD患者死亡的主要原因為巨結(jié)腸性小腸結(jié)腸炎，其發(fā)病率高達42%，嚴重影響患者生活質(zhì)量并威脅患者生命安全[2，3]。HD及術后HAEC的發(fā)病機制尚不明確，miRNA是一類單鏈非編碼RNA，其在腸黏膜炎癥反應、機體免疫、腫瘤形成以及腸上皮細胞增殖與凋亡等方面均產(chǎn)生重要影響。Neudecker等[4]發(fā)現(xiàn)miR-223可通過抑制炎癥反應來調(diào)節(jié)腸道炎癥。Wang等[5]研究表明，在壞死性小腸結(jié)腸炎患者中miR-223作為促炎因子呈高表達，并進一步引起腸道的炎癥及免疫反應。目前，國內(nèi)關于HD與miR-223及相關炎癥因子的研究仍未有涉及。因此，本研究探討HD患者血清miR-223與炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-8)水平及其臨床意義。

材料與方法

一、一般資料

選取2017年1月至2018年8月在棗莊市立醫(yī)院行HD根治術的患者作為研究對象。納入標準： ①經(jīng)臨床癥狀初步診斷、查體與鋇劑灌腸提示HD，并經(jīng)術后病理證實； ②均行一期根治手術(包括 Soave 術和Ikedasoper術)； ③術前未出現(xiàn)HAEC； ④獲得患者監(jiān)護人的知情同意。排除標準： ①合并惡性腫瘤； ②合并嚴重心、肝、腎等臟器疾?。?③合并其他感染性疾?。?④臨床資料不完整。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。最終納入66例HD患者作為觀察組。同時參照HD患者基線資料選取同時期健康患者70例作為健康組。觀察組和健康組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明兩組具有可比性，見表1。

表1 觀察組和健康組一般資料比較Table 1 Comparison of general profiles between observation and healthy groups分組n性別(男/女)年齡[歲,(x±s)]BMI[kg/m2,(x±s)]健康組7053/171.10±0.3616.20±2.09觀察組6650/160.95±0.3016.17±2.06t/χ2值-0.5691.6900.084P值-0.4510.0930.933

二、檢測方法

入院時抽取患者靜脈血約5 mL，離心(3 500 r/min,15 min)后取上層清液。常規(guī)生化檢測白細胞(white blood cell,WBC)、紅細胞(red blood cell,RBC)、血紅蛋白(Hemoglobin,HGB)、白蛋白(albumin,ALB)、球蛋白(Globulin,GLO)、前白蛋白(Prealbumin,PA)。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測TNF-α、IL-6、IL-8水平，實驗操作嚴格按照說明書(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)執(zhí)行。應用總RNA提取試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)提取總RNA，并同時檢測其吸光度值。取2 μg總RNA置于反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)中合成cDNA，采用PCR儀將cDNA進行擴增。反應條件為：94℃ 10 min預變；94℃ 45 s、60℃ 45 s、72℃ 45 s，40個循環(huán)。用2-ΔΔCt表示患者血清中miR-223的相對表達量。

三、術后隨訪及HAEC診斷評分系統(tǒng)

由Park等[6]提出，評估HD相關性HAEC項目包括：臨床病史、體格檢查、影像學檢查(腹部立位X線片)、食鹽水檢查(白細胞以及有無核轉(zhuǎn)移)等。術后隨訪6個月，隨訪截止時間為2019年2月28日，HAEC評分≥10分即診斷為HD相關性HAEC，HAEC評分<10分表示患者術后未出現(xiàn)HAEC。根據(jù)術后隨訪是否出現(xiàn)HAEC將觀察組患者分為HAEC組和非HAEC組。對比分析兩組患者手術年齡、性別、術前身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、巨結(jié)腸類型、術前相關生化指標(WBC、RBC、HGB、ALB、GLO、PA)、術前TNF-α、IL-6、IL-8等相關因素。

四、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、觀察組和健康組血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8比較

觀察組患者血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8均高于健康組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

二、HD患者術后發(fā)生HAEC的單因素分析

隨訪期間無一例失訪，亦無一例死亡。觀察組66例患者中有20例(30.30%)術后出現(xiàn)HAEC，即非HAEC組46例和HAEC組20例。經(jīng)單因素分析顯示，HAEC組患者血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8高于非HAEC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 觀察組和健康組血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8比較(x±s)Table 2 Comparison of serum levels of mir-223,TNF-α,IL-6 and IL-8 between observation and healthy groups(x±s)分組例數(shù)miR-223相對表達量TNF-α(pg/mL)IL-6(pg/mL)IL-8(pg/mL)觀察組663.86±0.8544.20±10.6632.40±8.6618.70±5.02健康組700.80±0.147.06±2.089.88±2.566.84±1.66t值-29.7028.5820.8218.70P值-<0.001<0.001<0.001<0.001

表3 HD患者術后發(fā)生HAEC的單因素分析Table 3 Univariate analysis of postoperative HAEC in HD children因素非HAEC組(n=46)HAEC組(n=20)χ2/t值P值手術年齡[n(%)]<1歲1～3歲>3歲27(71.05)12(66.67)7(70.00)11(28.95)6(33.33)3(30.00)0.1120.946性別[n(%)]男女35(87.50)11(68.75)15(12.50)5(31.25)0.0090.925巨結(jié)腸類型[n(%)]短段型常見型長段+全結(jié)腸16(69.57)20(71.43)10(66.67)7(30.43)8(28.57)5(33.33)0.1050.949術前BMI[kg/m2,(x±s)]16.10±2.0516.32±2.100.3620.719WBC[×109/L,(x±s)]10.66±3.1511.28±3.200.7310.467RBC[×1012/L,(x±s)]4.68±0.804.86±0.880.8150.418HGB[g/L,(x±s)]110.96±26.50112.45±30.330.2010.841ALB[g/L,(x±s)]42.80±10.0843.66±11.040.3100.758GLO[g/L,(x±s)]22.04±5.6020.10±5.141.3240.190PA[mg/L,(x±s)]166.28±40.10180.30±50.701.2030.233TNF-α[pg/mL,(x±s)]39.06±10.3347.60±11.023.0250.004IL-6[pg/mL,(x±s)]28.40±7.6636.05±8.463.6130.001IL-8[pg/mL,(x±s)]16.20±4.0223.06±6.555.217<0.001miR-223相對表達量(x±s)3.16±0.754.25±0.805.318<0.001

三、HD患者術后發(fā)生HAEC的多因素Logistic回歸分析

將以上單因素分析中有統(tǒng)計學意義的因素(對于連續(xù)變量數(shù)據(jù)，以中位數(shù)取臨界點轉(zhuǎn)換成二分類資料)納入二元Logistic多因素回歸分析。結(jié)果顯示，HD患者術前高表達的血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8均是術后發(fā)生HAEC的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

四、HD患者術前血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8預測術后HAEC的ROC曲線分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，HD患者術前血清miR-223、IL-6、TNF-α、IL-8預測術后HAEC的ROC曲線下面積分別為0.889、0.826、0.678、0.657,詳見圖1和表5。

表4 HD患者術后發(fā)生HAEC的多因素二元Logistic回歸分析Table 4 Multivariate logistic regression analysis of HAEC in HD children變量β值Wald χ2值P值OR值(95%CI)TNF-α>43.20(pg/mL)0.8396.6070.0102.314(1.806,7.366)IL-6>32.20(pg/mL)0.67014.805<0.0012.007(1.605,6.714)IL-8>20.10(pg/mL)0.6827.8130.0051.978(1.220,6.660)miR-223相對表達量>3.651.6317.0040.0085.110(3.402,10.644)

表5 HD患者術前血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8預測術后HAEC的ROC曲線分析Table 5 ROC curve analysis of predicting postoperative HAEC with preoperative levels of mir-223,TNF-α,IL-6 and IL-8 in HD children變量曲線下面積截斷值靈敏度(%)特異度(%)P值曲線下面積95%CI下限上限miR-223相對表達量0.8893.9086.7080.00<0.0010.7950.983IL-6(pg/mL)0.82645.1583.3075.00<0.0010.7050.947TNF-α(pg/mL)0.67834.2060.0075.000.0350.5240.831IL-8(pg/mL)0.65721.6060.0080.000.0430.4980.815

圖1 HD患者術前血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8預測術后HAEC的ROC曲線

討 論

HAEC是HD手術的主要并發(fā)癥。自Harald于1886年首次向柏林國際兒童疾病大會提交了2例HAEC患者病例資料后，各國醫(yī)學專家學者都致力于對HAEC進行病因?qū)W、病理學、遺傳學等的相關研究[7]。目前認為可能與腸管機械性擴張、腸道防御屏障異常、腸道感染以及基因表達異常有關[8,9]。其中，正常的腸道防御屏障可阻止病原微生物跨結(jié)腸上皮侵入，減少細菌感染，而腸道防御功能異常則會引發(fā)相關疾病[10,11]。TNF-α、IL-6和IL-8 均由炎癥反應激活的炎癥細胞合成分泌，具有促炎作用，均屬于常見的炎癥反應標志物。胡星等[12]研究表明，先天性巨結(jié)腸相關性小腸結(jié)腸炎患者血清TNF-α、IL-6和IL-8 均高于正常人群，且與HAEC評分呈正相關，提示炎癥反應在HD相關性HAEC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，炎癥系統(tǒng)被激活進而使炎癥反應加速，炎癥反應因子水平升高，最終引發(fā)HAEC。該研究認為TNF-α、IL-6和IL-8等炎癥因子在HD相關性HAEC病情評估中具有較高的臨床價值。同時，本研究結(jié)果顯示，HD患者術前血清TNF-α、IL-6、IL-8均高于健康組，HD術后HAEC患者術前血清TNF-α、IL-6、IL-8均高于非HAEC組，提示HD患者術前血清TNF-α、IL-6、IL-8呈高表達，與術后HAEC密切相關，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。進一步多因素Logistic分析發(fā)現(xiàn)，HD患者術前血清TNF-α、IL-6、IL-8高水平是引發(fā)術后HAEC的獨立危險因素。因此，臨床可根據(jù)HD患者術前的炎癥因子水平給予對應的干預措施，可減少術后HAEC的風險。

作為本世紀生命科學領域的一個重大發(fā)現(xiàn)，miRNA被發(fā)現(xiàn)在疾病的發(fā)生發(fā)展和生物進化等生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miR-223作為一種重要的miRNA，多項實驗表明，miR-223對脂質(zhì)代謝、炎癥和癌變等都具有重要意義[13]。近年來，人們逐漸認識到miR-223作為靶向調(diào)控因子在多種疾病的診斷和預測中起到重要作用。有研究表示，miR-223在腸黏膜炎癥反應、先天免疫、腫瘤生成等方面均發(fā)揮著重要作用，miR-223可通過多種途徑對腸道炎癥或者免疫反應進行調(diào)節(jié)，進而影響多種腸道生理及病理過程[14-16]。楊麗等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-223在壞死性小腸結(jié)腸炎患者中顯著上調(diào)。經(jīng)生物學分析發(fā)現(xiàn)，CLDN8、FOXO3a、NLRP8、ICAM1等主要的miR-223的靶基因可通過PPAR、MAPK等多種信號通路參與腸道屏障系統(tǒng)組成以及腸道炎癥和免疫調(diào)節(jié)等過程，在相關腸道疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。其中，CLDN8是組成腸道屏障的重要部分，當腸道感染時，miR-223顯著上調(diào)，促進炎癥反應，同時抑制靶基因CLDN8的表達，并激活IL-23/T17細胞通路，進而破壞腸道屏障功能，進一步加劇腸道炎癥[5]。因此，推測miR-223對HD患者術后HAEC可能有重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，HD患者術前miR-223高于健康組，HD術后HAEC患者術前miR-223高于非HAEC組，提示HD患者術前miR-223呈高表達，與術后HAEC密切相關，這與上述研究結(jié)果一致。但是，在Neudecker等[18]對小鼠的實驗中，腸炎樣本miR-223相對表達量升高，而高表達的miR-223可通過抑制NLRP3炎性體及IL-8從而減輕實驗性腸炎。這與本研究結(jié)果存在一定差異，可能與研究對象和實驗方法不同有關，因此需對此領域進一步研究。進一步多因素Logistic分析發(fā)現(xiàn)，HD患者術前miR-223高表達是引發(fā)術后HAEC的獨立危險因素。因此，積極對HD患者術前進行miR-223的檢測，可及時作出有效的預防措施，減少術后HAEC的發(fā)生。

ROC曲線分析結(jié)果顯示，HD患者術前血清miR-223、IL-6、TNF-α、IL-8預測術后HAEC的ROC曲線下面積分別為0.889、0.826、0.678、0.657，對應截斷值分別為3.90 pg/mL(靈敏度=86.70%，特異度=80.00%)、34.20 pg/mL(靈敏度=83.30%，特異度=75.00%)、45.15 pg/mL(靈敏度=60.00%，特異度=75.00%)、21.60 pg/mL(靈敏度=60.00%，特異度=80.00%)?？梢姡琀D患者術前miR-223、IL-6、TNF-α、IL-8對術后HAEC均有較高的預測效能，臨床可通過對術前相關指標的檢測，來進行術后HAEC的風險評估，及時采取干預方案，提高HD患者生存質(zhì)量。由于本研究存在樣本量較小、觀察時間較短等不足，結(jié)果可能會存在一定偏倚，因此仍需更深入的研究予以進一步證實。

綜上所述，先天性巨結(jié)腸患者術前血清miR-223、IL-6、TNF-α、IL-8高表達，且是術后發(fā)生HAEC的獨立危險因素；同時術前血清miR-223、IL-6、TNF-α、IL-8對術后HAEC的發(fā)生具有較高的預測價值，臨床可通過對術前相關指標的檢測，來進行術后HAEC的風險評估，以及時作出干預，提高患者生存質(zhì)量。