王麗惠，張佳祥，劉雙平，張惠勇，盧秋燕，沈培根

我國(guó)是肝病發(fā)生率較高的國(guó)家，肝病是全球范圍內(nèi)引起死亡的重要原因之一[1]。肝損傷是肝病的主要表現(xiàn)，而引起肝損傷的因素也較多，免疫性肝損傷主要是外界異物進(jìn)入體內(nèi)，引起免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝組織大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從而引起肝損傷[2，3]。原兒茶酸是一種天然的芬酸類物質(zhì)，廣泛存在于蔬菜和水果中，也是很多中草藥的主要藥效成分[4]。研究表明，原兒茶酸除了具有抗血小板凝聚、降低心肌耗氧量等藥理作用外[5]，還具有很好的體外抗氧化活性，能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷[6，7]，表明其對(duì)神經(jīng)損傷具有一定的保護(hù)作用，但尚未有原兒茶酸對(duì)免疫性肝損傷具有保護(hù)作用的相關(guān)研究報(bào)道。本研究采用刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型，探討了原兒茶酸抗肝損傷作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 SPF級(jí)雄性昆明小鼠60只，體質(zhì)量為19.37±1.24 g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018]，飼養(yǎng)在武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(鄂)2015-0025]。原兒茶酸(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：20140812)；刀豆球蛋白A(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：201608)；檢測(cè)白介素-4(IL-4)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；UV 1100紫外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)有限公司)；VARIOSKAN FLASH 2.4.3型全波長(zhǎng)多功能讀數(shù)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 免疫性肝損傷模型的制備 隨機(jī)將60只小鼠分為對(duì)照組、模型組、小、中、大(2.5 mg·kg-1·d-1、5 mg·kg-1·d-1、10 mg·kg-1·d-1)原兒茶酸和(0.2 g·kg-1·d-1)聯(lián)苯雙酯處理組，在對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃處理，在藥物處理組分別給予不同劑量的藥物灌胃，連續(xù)10 d。在末次給藥1 h后，經(jīng)尾靜脈注射ConA 35 mg.kg-1，誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠模型。在造模8 h后，稱量體質(zhì)量，摘眼球取血，采用脫頸法處死動(dòng)物，剖取肝臟和脾臟，稱量并計(jì)算肝、脾臟質(zhì)量指數(shù)(分別=肝、脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)；對(duì)抽取的血液經(jīng)3000 r/m離心10 min，分離血清，保存于-20℃待測(cè)；剪取小部分肝組織，于冰上研磨成肝組織勻漿，離心后取上清，保存于-20℃待測(cè)；另取部分肝組織，用10%甲醛固定，制成組織切片，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠臟器指數(shù)比較 與正常組小鼠比，模型組小鼠肝和脾臟指數(shù)均顯著升高，不同劑量原兒茶酸和聯(lián)苯雙酯處理后，肝、脾臟指數(shù)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組小鼠臟器指數(shù)比較

2.2 各組小鼠血生化水平比較 與正常組小鼠比，模型組小鼠血清ALT和AST水平均顯著升高，不同劑量原兒茶酸和聯(lián)苯雙酯處理后，血清ALT和AST水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 各組小鼠血生化指標(biāo)比較

2.3 各組小鼠血清炎性細(xì)胞因子水平比較 與正常組小鼠比，模型組小鼠血清IL-4、IL-6和TNF-α水平均顯著升高，不同劑量原兒茶酸和聯(lián)苯雙酯處理后，血清IL-4、IL-6和TNF-α水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 各組小鼠血清細(xì)胞因子水平比較

2.4 各組小鼠肝組織勻漿MDA、NO、SOD和GSH-PX水平比較 與正常組小鼠比，模型組小鼠肝組織勻漿MDA和NO水平顯著升高，而SOD和GSH-PX活性顯著降低，不同劑量原兒茶酸和聯(lián)苯雙酯處理后，MDA和NO水平顯著降低，SOD和GSH-PX活性顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

表4 各組小鼠肝組織勻漿MDA、NO、SOD和GSH-PX水平比較

2.5各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯損傷；模型組小鼠可見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹，并伴有大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)；不同劑量原兒茶酸和聯(lián)苯雙酯處理后，肝細(xì)胞腫脹程度顯著減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度也明顯減少(圖1)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，400×)

3 討論

ConA誘導(dǎo)的肝損傷模型是目前篩選肝病治療的理想模型之一，其具有較好的肝臟特異性，并且造模過(guò)程簡(jiǎn)單快速，能夠在一定程度上模擬人類病毒性肝病和自身免疫性肝病的病理學(xué)變化過(guò)程[8，9]。用不同劑量的ConA處理小鼠能引起肝損傷，并以壞死為主，并且模型較穩(wěn)定[10]。因此，本研究選擇ConA建模[11]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)ConA處理后，小鼠血清ALT和AST顯著升高，而經(jīng)不同劑量的原兒茶酸處理后，血清上述指標(biāo)水平顯著降低，表明原兒茶酸具有一定的肝損傷保護(hù)功能。

目前研究顯示，ConA導(dǎo)致的免疫性肝損傷模型均伴有各種免疫反應(yīng)，而這些免疫反應(yīng)有多種免疫細(xì)胞和炎癥因子的介導(dǎo)[12]。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有重要生物活性的細(xì)胞抑制劑，在機(jī)體免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、組織重構(gòu)、細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用[13]。有研究顯示，ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷過(guò)程伴有TNF-α表達(dá)水平升高[14]。IL-4和IL-6均是免疫調(diào)節(jié)因子和炎癥介質(zhì)，IL-4主要由活化的T細(xì)胞合成，能夠促進(jìn)T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞分化并能激活Th2細(xì)胞為主的免疫應(yīng)答[15]，而IL-6主要通過(guò)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外基質(zhì)的增生，是引起肝臟炎癥的重要因素[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血清TNF-α、IL-4和IL-6水平均顯著升高，而不同劑量的原兒茶酸處理后，小鼠血清這些細(xì)胞因子水平顯著降低，表明原兒茶酸可能通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子的合成和分泌，進(jìn)而保護(hù)肝臟。

人體在生理和病理過(guò)程中均有氧自由基的形成，后者在機(jī)體正常的生化反應(yīng)過(guò)程中充當(dāng)著重要的中間體，但過(guò)量的氧自由基會(huì)引起組織的損傷和破壞，因此機(jī)體有一套完整的抗氧化酶防御自由基損傷系統(tǒng)[17]。SOD作為其中重要的一種內(nèi)涵性金屬酶，能夠?qū)⒊踝杂苫缁癁檫^(guò)氧化氫，在GSH-PX的作用下繼續(xù)轉(zhuǎn)化為水，進(jìn)而清除過(guò)量的氧自由基，而在免疫性肝損傷過(guò)程中，氧自由基大量生成，而SOD和GSH-PX等活性受到抑制，未被清除的氧自由基會(huì)攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)，形成脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，MDA作為該過(guò)程的終產(chǎn)物，能夠間接反映機(jī)體受自由基攻擊的程度[18]。NO則作為一種活性介質(zhì)，在肝損傷過(guò)程中發(fā)揮著雙重作用，既發(fā)揮著維持正常生理功能的作用，又參與病理性損傷過(guò)程[19]。本研究結(jié)果顯示，在ConA處理小鼠，肝組織勻漿MDA和NO水平顯著升高，而SOD和GSH-PX活性顯著降低，表明肝組織發(fā)揮了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，而MDA能夠嚴(yán)重地?fù)p傷肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞腫脹、壞死。經(jīng)過(guò)不同劑量的原兒茶酸處理后，組織MDA和NO水平顯著降低，而SOD和GSH-PX活性顯著升高，可能是因?yàn)樵瓋翰杷岜旧砭褪且环N抗氧化劑，能夠有效中和體內(nèi)過(guò)量的氧自由基，解除對(duì)SOD和GSH-PX活性的抑制作用，從而減少對(duì)肝細(xì)胞脂膜的攻擊，進(jìn)而保護(hù)了肝組織[20]。