范月瑩，張洪，馮豆，宋玲，譚佳杰（武漢大學人民醫(yī)院藥學部，武漢 430060）

肝纖維化是肝臟對由多種因素如炎癥、病毒及免疫引發(fā)的肝損傷的一種反應[1-2]，若肝臟持續(xù)受損，肝細胞則釋放相關(guān)因子，從而激活肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs），產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），而ECM 的積累會導致肝纖維化[3]。雖然有相關(guān)臨床藥物應用，但還未能產(chǎn)生理想的療效。研究人員正致力于尋找療效佳、不良反應少的藥物，希望能夠延緩、抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進程。眾多臨床實踐及實驗發(fā)現(xiàn)，中藥的藥理作用具有多成分、多途徑、多層次及多靶點等特征，能夠緩解肝纖維化和肝硬化進程[4]。

苦豆子SophoraalopecuroidesL.是一種傳統(tǒng)中草藥，臨床上用于治療腸炎及急性細菌性痢疾[5-6]?？喽箟A（aloperine，ALO）屬于喹諾里西啶類生物堿[7]，來源于苦豆子。研究發(fā)現(xiàn)苦豆堿具有抗炎、抗病毒及抗腫瘤等藥理作用，且作用明顯[8-10]，但苦豆堿對肝纖維化的作用尚未有相關(guān)報道。本研究主要探究苦豆堿對在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的LX-2 細胞的影響。

1 材料

1.1 儀器與試藥

HERAcell 160i 細胞CO2培養(yǎng)箱（美國 Thermo Fisher）；SWCJ1F 細胞操作超凈臺（蘇州安泰公司）；TC20 細胞計數(shù)儀（美國 BIO-RID）；EnSight酶標儀（美國 Perkin Elmer）；FASC Calibur 流式細胞分析儀（美國 Becton Dickinson 公司）；C1000普通PCR 儀、CFX 熒光定量PCR 儀（美國BIORAD）；DYY-7C 電泳儀（北京六一）；Odyssey 雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國 LI-COR）。

ALO（批號：19101122，北京科展生物科技有限公司，純度＞97.5%）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號：201020101）、胎牛血清（批號：19110505）、 含0.25% EDTA 胰蛋白酶（批 號：1912290101）（美國Gibco 公司）；磷酸鹽緩沖液（批號：20190725，武漢谷歌生物有限公司）；轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β1，批號：BGK01137，美國PeproTech 公司）；CCK-8 檢測試劑盒（批號：C0039，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；碘化丙啶（PI，批號：20191205，武漢安特捷生物技術(shù)有限公司）；RNase A（批號：9001-99-4，德國Biofroxx 公司）；PE-Annexin V/7AAD 凋亡試劑盒（批號：559763，美國 BD 公司）；PrimeScript RT Reagent Kit（批號：RR037Q）、TB Green Premix Ex Taq 試劑盒（批號：RR420Q）（TaKaRa 公司）；β-actin 引物（批號：2019-12-20）、Collagen-Ⅰ引物（批號：2019-12-25）、Collagen-Ⅰ一抗（批號：181304）（武漢賽維爾生物科技有限公司）；β-actin一抗（批號：6，美國Cell Signaling Technology公司）。

1.2 細胞

人肝星狀細胞 LX-2（批號：BNCC341818，北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司）；人正常肝細胞 L-02（武漢大學人民醫(yī)院中心實驗室惠贈）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

LX-2 細胞和L-02 細胞均于含10%胎牛血清、1%雙抗（100 U·mL－1青霉素、100 U·mL－1鏈霉素）的 DMEM 高糖培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期，用胰酶消化，傳代培養(yǎng)，取第3 ～8 代細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 CCK-8 法檢測ALO 對LX-2 細胞增殖的影響

實驗分7 組：陰性對照（negative control，NC）組，TGF-β1誘導組和5 個實驗組。收集對數(shù)生長期的LX-2 細胞，調(diào)整細胞濃度為3×104個·mL－1，每孔滴加100 μL，接種于96 孔板中，37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將 NC 組細胞培養(yǎng)液更換為完全培養(yǎng)基，其余組細胞培養(yǎng)液更換為含有5 ng·mL－1TGF-β1的完全培養(yǎng)基，24 h 后將實驗組細胞用含20、40、60、80、100 μg·mL－1ALO 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。給藥24 h 和48 h 后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入990 μL DMEM高糖培養(yǎng)基和10 μL CCK-8 試劑，37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h 后，酶標儀測定波長為450 nm 的吸光度（A）值，并計算細胞的生長抑制率。抑制率＝（1－A實驗組/A對照組）×100%。本實驗平行重復5 次。

2.3 ALO 對L-02 細胞的毒性

細胞接種和培養(yǎng)方法同“2.2”項下。設置NC組和ALO 為20、40、60、80、100 μg·mL－1實驗組，每組4 個復孔。24 h 后測定吸光度，檢測方法同“2.2”項下。

2.4 ALO 對LX-2 細胞周期的影響

實驗分為5 組：NC 組，TGF-β1誘導組和20、60、100 μg·mL－1ALO 實驗組。收集對數(shù)生長期的 LX-2 細胞，調(diào)整細胞濃度為3×105個·mL－1，每孔滴加2 mL 接種于6 孔板，培養(yǎng)過夜。用無血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基饑餓處理各組細胞 24 h，后續(xù)細胞處理同“2.2”項下。收集細胞，取細胞懸液加入預冷的75%乙醇，加入PI 染色，同時加入 RNase A 去除RNA 的干擾，2 h 內(nèi)用流式細胞術(shù)進行細胞周期測定。本實驗平行重復3 次。

2.5 ALO 對于LX-2 細胞凋亡的影響

實驗分組同“2.4”項下。取對數(shù)生長期 LX-2細胞，調(diào)整細胞濃度為4×105個·mL－1，每孔加入2 mL 接種于6 孔板，培養(yǎng)過夜后按照分組加入相應的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。用預冷的PBS 洗2遍，使用不含EDTA 的胰酶對細胞進行消化，收集，每組細胞加入100 μL Binding Buffer 重懸細胞，加入5 μL 的PE 和7-AAD 染色劑混勻，避光孵 育25 min，混 入400 μL Binding Buffer，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。本實驗平行重復3 次。

2.6 Collagen-Ⅰ mRNA 相對表達量

實驗分組同“2.4”項下。取對數(shù)生長期 LX-2細胞，以5×105個·mL－1，每孔2 mL 細胞懸液接種于6 孔板，培養(yǎng)過夜。實驗組給藥處理24 h后，加入含有5 ng·mL－1TGF-β1的培養(yǎng)液刺激LX-2 細胞2 h。細胞處理完畢后用胰酶消化并收集細胞，提取細胞 mRNA 并逆轉(zhuǎn)錄，之后進行PCR 擴增檢測，以β-actin 為內(nèi)參，按照 2－△△CT算法計算 Collagen-Ⅰ mRNA 相對表達量。引物序列為Forward：ACTGGGAGACCTGCGTGTA，Reverse：AATCCATCGGTCATGCTCTC。本實驗平行重復3 次。

2.7 Collagen-Ⅰ蛋白相對表達量

實驗分組及處理同“2.6”項下，提取細胞總蛋白，用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，用Odyssey 測定蛋白表達量。本實驗平行重復3 次。

2.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0 軟件對所得結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)資料采用±s表示，組間分析采用方差分析和t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 ALO 對 LX-2 細胞增殖的影響

TGF-β1誘導組與 NC 組相比，細胞增殖顯著增多（P＜0.01）。與TGF-β1誘導組相比，除給藥質(zhì)量濃度為20 μg·mL－1的實驗組，其余各實驗組細胞在培養(yǎng)24 h、48 h 后，增殖均受到明顯抑制（P＜0.01，P＜0.001），且呈劑量依賴性，結(jié)果見圖1。

圖1 ALO 對 LX-2 細胞增殖的影響（n ＝5）Fig 1 Effect of ALO on proliferation of LX-2 cells（n ＝5）

3.2 ALO 對 L-02 細胞的毒性

如圖2 所示，與NC 組相比，實驗組L-02 細胞生長受到明顯抑制，且隨著給藥濃度增大，生長抑制率提高。ALO 各濃度為實驗組對L-02 細胞抑制率均低于20%，其中20、40、60 μg·mL－1組細胞抑制率均低于10%。ALO 對于正常肝細胞L-02 的細胞毒性在可接受范圍。

圖2 ALO 對 L-02 細胞生長的影響（n ＝5）Fig 2 Effect of ALO on the growth of L-02 cells（n ＝5）

3.3 ALO 對 LX-2 細胞周期的影響

如圖3 所示，與TGF-β1誘導組相比，各給藥組細胞G1期比例明顯提升（P＜0.001），S 期G2期細胞比例明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），表明 ALO 作用于 LX-2 細胞24 h 后，能夠顯著促進細胞周期阻滯在G1期。

圖3 ALO 對 LX-2 細胞周期的影響（n ＝3）Fig 3 Effect of ALO on cell cycle of LX-2（n ＝3）

3.4 ALO 對 LX-2 細胞凋亡的影響

如圖4和圖5所示，NC組，TGF-β1誘導組及20、60、100 μg·mL－1ALO實驗組的細胞凋亡率分別為（4.26±0.30）%、（4.03±0.15）%、（4.46±0.29）%、（8.12±0.49）%、（8.98±1.01）%。與TGF-β1誘導組相比，除TGF-β1＋20 μg·mL－1ALO 組，其余各給藥組細胞凋亡比例明顯提高（P＜0.001），且呈劑量依賴性。

圖4 ALO 對 LX-2 細胞凋亡率的影響（n ＝3）Fig 4 Effect of ALO on apoptosis rate of LX-2 cells（n ＝3）

圖5 ALO 對 LX-2 細胞凋亡的影響Fig 5 Effect of ALO on apoptosis of LX-2 cells

3.5 ALO 對Collagen-Ⅰ mRNA 相對表達量的影響

TGF-β1誘導組和實驗組 LX-2 細胞中Collagen-ⅠmRNA 相對于NC 組的表達量分別為（2.778±0.254）、（2.196±0.155）、（1.475±0.101）、（1.178±0.228）。與 TGF-β1誘導組相比，實驗組細胞Collagen-Ⅰ mRNA 相對表達量均顯著降低（P＜0.001），且呈劑量依賴性，但仍無法降低至正常水平，結(jié)果如圖6 所示。

3.6 ALO 對Collagen-Ⅰ蛋白相對表達量的影響

NC 組，TGF-β1誘導組及20、60、100 μg·mL－1ALO 實驗組 LX-2 細胞中Collagen-Ⅰ 蛋白相對表達量分別為（0.209±0.006）、（0.233±0.005）、（0.200±0.004）、（0.175±0.009）、（0.172±0.007）。與 TGF-β1誘導組相比，實驗組細胞Collagen-Ⅰ蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.001），且呈劑量依賴性，表明ALO 顯著抑制了Collagen-Ⅰ 蛋白的表達，結(jié)果見圖7。

圖6 ALO 對Collagen-Ⅰ mRNA 相對表達量的影響（n ＝3）Fig 6 Effect of ALO on relative expression of Collagen-Ⅰ mRNA（n ＝3）

圖7 ALO 對 Collagen-Ⅰ蛋白表達的影響（n ＝3）Fig 7 Effect of ALO on the expression of Collagen-Ⅰ protein（n＝3）

4 討論

肝纖維化是以Collagen-Ⅰ 等ECM 的過度積累為特征，由多種因素導致的肝臟慢性損傷所引起的病理過程[3]。肝纖維化的不斷進展會使肝功能受損，最終可能會發(fā)展成為終末期肝硬化甚至肝細胞癌[11-12]。HSCs 的活化被認為是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟[13]。肝臟受到損傷后，靜止的HSCs 被激活并分化為成纖維細胞，并迅速增殖，產(chǎn)生大量ECM[14]。因此，治療肝纖維化的重要手段是抑制HSCs 的活化，阻礙膠原蛋白的表達，抑制活化的HSCs 增殖，促進其凋亡[15]。

LX-2 是永生化的人肝星狀細胞系，被廣泛應用于體外研究肝纖維化[16]。Xu 等[17]從人正常肝組織中分離HSCs 并進行永生化處理，得到LX-1 和LX-2 細胞系，經(jīng)過免疫組化、Western blot、qPCR等實驗發(fā)現(xiàn)，兩種細胞系與原代HSCs 相似，均能表達調(diào)節(jié)肝纖維化的關(guān)鍵受體等蛋白，而LX-2 相比于LX-1，具有更高的可轉(zhuǎn)染性，且能夠更好地抵抗無血清培養(yǎng)，因此更適合用于體外實驗。

TGF-β是促纖維化因子，同時也是治療纖維化的重要靶點[18]，TGF-β蛋白存在3 種異構(gòu)體，分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其 中TGF-β1是在肝纖維化中研究得最深入最廣泛的異構(gòu)體[19]。TGF-β1在纖維化發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它能夠刺激ECM的產(chǎn)生和積累并減少基質(zhì)金屬蛋白酶對ECM 的降解[20]。體外實驗常利用 TGF-β1刺激LX-2 細胞，如Xiang 等[21]為探究酸漿果紅素D 對于LX-2 細胞活化等作用，采用5 ng·mL－1TGF-β1處理LX-2 細胞使其活化。肖琳等[22]設置系列質(zhì)量濃度（0、0.5、1、5、10 ng·mL－1）TGF-β1刺激LX-2，結(jié)果顯示5 ng·mL－1TGF-β1為最佳效應濃度。

ALO 具有抗腫瘤和抗炎等作用[23]，有研究表明，其能夠提高人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力，減輕動脈粥樣硬化和內(nèi)皮炎癥[24]。另外有研究表明[25]，ALO 能通過抑制成纖維細胞的增殖和分化來減輕小鼠肺纖維化?？紤]到ALO 對炎癥和纖維化過程發(fā)揮作用，筆者在本研究中探究了ALO 對于LX-2 的影響。通過CCK-8 實驗，本研究驗證了ALO 對于活化的LX-2 細胞增殖具有抑制作用，同時確定了后續(xù)給藥濃度和給藥時間。為保證細胞具有較好的活性及狀態(tài)，筆者設置ALO 對細胞的作用時間為24 h。而給藥24 h 時，ALO 對于正常肝細胞L-02 毒性較小，安全性較高。本實驗還證明ALO 能夠顯著誘導活化的LX-2 細胞周期阻滯，進而抑制細胞的生長，并且促進活化的 LX-2 細胞凋亡。此外，通過PCR 和Western blot 實驗發(fā)現(xiàn)，ALO 能夠顯著抑制ECM中的重要成分Collagen-Ⅰ 的mRNA 和蛋白表達，減弱TGF-β1對LX-2 細胞的激活作用。

但本實驗仍存在較大不足，本研究對于ALO作用于LX-2 細胞增殖、凋亡和活化的機制并未深入探究，且只探究了ALO 在體外對于細胞的作用，未進行動物實驗。后續(xù)將深入研究ALO對LX-2 細胞周期蛋白、凋亡蛋白及TGF-β/Smad通路的作用并進行體內(nèi)實驗。

綜上，本實驗證明，ALO 能夠抑制活化后的HSCs 的增殖，促進其周期阻滯和凋亡，同時阻礙其進一步活化，減少Collagen-Ⅰ 的產(chǎn)生和積累，為后續(xù)研究ALO 對于肝纖維化進程的影響奠定基礎(chǔ)。