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        中藥爵床抗血小板聚集的活性物質及作用機制研究

        2021-04-30 03:10:12陳鵬宇姚云峰張瑩柯辛格余兵吳和珍楊艷芳肖學成湖北中醫(yī)藥大學藥學院武漢430065中藥資源與中藥化學湖北省重點實驗室武漢430061老年病中藥新產品湖北省協同創(chuàng)新中心武漢430061
        中南藥學 2021年3期
        關鍵詞:誘導劑藥組溶劑

        陳鵬宇,姚云峰,張瑩,柯辛格,余兵,吳和珍,3,楊艷芳,3,肖學成(1.湖北中醫(yī)藥大學藥學院,武漢 430065;2.中藥資源與中藥化學湖北省重點實驗室,武漢 430061;3.老年病中藥新產品湖北省協同創(chuàng)新中心,武漢 430061)

        血栓形成是由于血管或心臟內流動的血液變?yōu)楣虘B(tài)。血栓會導致血流阻塞,引發(fā)心肌梗死或者中風等血栓性疾病,對人們的健康產生嚴重危害[1];血小板是一種無核細胞,來自于骨髓巨核細胞,它的黏附、聚集、釋放對于血管內血栓的形成具有重要作用。影響血小板的黏附、聚集等過程也是抗血栓藥物研發(fā)的主流靶點[2-4]。阿司匹林、氯吡格雷等化學藥物具有抗血小板聚集的作用,是目前臨床上常用的血小板聚集抑制劑,其被廣泛運用于治療血栓性疾病[5]。但這些藥物往往存在著作用機制單一、不良反應較大的缺點,難以被需要長期服藥的患者所接受。故篩選安全有效的新的抗血小板聚集藥物有著十分重要的意義。整合素β3主要在血小板中表達,是抗血小板治療的首要靶點。根據課題組前期實驗,初步確定爵床提取物抗血小板聚集的可能靶蛋白為整合素β3。

        中藥是新藥研發(fā)的寶庫,其安全性和有效性在幾千年的藥用歷史中得到了檢驗?!渡褶r本草經》最早收錄了爵床,記載其味辛苦咸,性寒,入肝、肺、膀胱經,主治清熱解毒、利尿消腫、截瘧[6]。爵床中主要含有黃酮、生物堿、木脂素以及三萜類等成分,根據現代藥理學研究,爵床具有鎮(zhèn)痛、抑菌、抗炎以及抗腫瘤的作用[7-9]。課題組前期研究證實,爵床中的活性物質可以抑制血小板聚集,但具體的藥效物質基礎、作用機制還不完全清楚[10]。本文通過大孔吸附樹脂法、制備性液相色譜法等分離純化爵床中的活性成分,得到單體成分;構建動物模型來篩選活性物質,通過體外血小板實驗和體內實驗驗證其藥效,并初步探索抗血小板聚集的作用機制,為爵床進一步研究提供理論基礎和實驗數據。

        1 材料

        1.1 試藥

        爵床藥材采于湖北宜昌,由湖北中醫(yī)藥大學藥學院的吳和珍教授鑒定為爵床科植物爵床[Rostellularia procumbens(Lin.)Nees]的干燥全草。

        D101 大孔吸附樹脂(M0041)、角叉菜膠(C8830)(Solarbio 公 司);LDH 試劑盒(批 號:A019-2-2,南京建成生物醫(yī)藥有限公司);凝血酶(Thrombin,THR,規(guī)格:100 units,批號:T6884)、膠原(Collagen,COL,規(guī)格:25 mg,批號:C7661)及二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP,規(guī)格:100 mg,批號:A2754)(美國Sigma公司);阿司匹林腸溶片(Aspirin,ASP,規(guī)格:100 mg/片,批號:J20171021,拜耳醫(yī)藥);復方丹參片(規(guī)格:0.32 g/片,批號:Z41021966,仲景宛西制藥);羅丹明鬼筆環(huán)肽300T(批號:CA1610,上海YEASEN 公司);RIPA 裂解液(批號:P0013B,碧云天);Integrinβ3抗體(批號:13166)、GAPDH 抗體(批號:5174)和二抗(批號:7074)(美國Cell Signaling Technology 公司)。

        1.2 儀器

        高效液相色譜儀(安捷倫1200)、Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱、Eclipse XDB-C18(9.4 mm×250 mm,5 μm)色譜柱(美國Agilent 公司);LX51-F22FL/PH 熒光顯微鏡(日本OLYMPUS 公司);LBY-NJ4 血小板聚集儀(北京泰利康信科技公司);電泳儀EPS600、微型垂直電泳槽VE180(上海天能科技有限公司);化學發(fā)光凝膠成像系統Fluor Chem FC3(美國ProteinSimple 公司)。

        1.3 實驗動物

        SPF 級雄性KM 小鼠60 只,體質量 18 ~20 g[許可證號:SCXK(鄂)2017-0012]、普通級新西蘭雄兔2 只,體質量 2 ~2.5 kg [許可證號:SCXK(鄂)2016-0011,湖北省疾病預防控制中心];SPF級雄性SD 大鼠72 只,體質量190 ~230 g [許可證號:SCXK(鄂)2017-0012,三峽大學實驗動物中心]。提供充足的水和飼料,環(huán)境溫度保持在20 ~22℃,相對濕度30%~50%,每日控制照明12 h,適應性喂養(yǎng)7 d 后開始試驗。

        2 方法

        2.1 篩選爵床抗血小板聚集活性部位

        2.1.1 爵床活性部位的分離 取25 kg 爵床藥材,粉碎,過2 號篩(24 目),按料液比1∶10(g/mL)加入80%乙醇滲漉提取后將滲漉液合并,溶劑減壓回收至無醇味,即得總提取液。以D101大孔吸附樹脂上樣總提取液,以30%~90%乙醇梯度洗脫,得到A 組322.4 g(30%乙醇洗脫流分)、B 組107.4 g(45%乙醇洗脫流分)以及C 組160.8 g(90%乙醇洗脫流分)。將各組的洗脫液減壓濃縮至近干。將適量的無水乙醇加入C 組浸膏中并超聲15 min 溶解,抽濾。重復數次以除去色素,將沉淀(RPE)樣品記為C1組(21.0 g),濾液記為C2組(126.6 g)。

        2.1.2 爵床活性部位的篩選 將KM 雄性小鼠隨機分成溶劑組、模型組、A 組、B 組、RPE 組、C2組,每組小鼠10 只。每日用0.5%CMC-Na 溶液給溶劑組和模型組小鼠灌胃,不同質量濃度的藥液給A 組、B 組、C1組、C2組小鼠灌胃,藥物以0.5%的CMC-Na 溶液制成混懸液。具體給藥劑量由前期的急性毒性實驗、預實驗結果以及各組分的含量確定。A 組、B 組、C1組和C2組的藥物質量濃度分別是16.1、5.4、1.1、6.3 mg·mL-1,分別相當于生藥量1.25、1.26、1.3、1.24 g·mL-1。每日灌胃一次并持續(xù)7 d。最后一次給藥前12 h禁食,自由飲水,給藥1 h 后腹腔注射0.2%的角叉菜膠溶液將給藥組與模型組小鼠造模,溶劑組腹腔注射等量生理鹽水。室溫控制為20℃。A 組、B 組、C1組、C2組小鼠給藥的體積為0.2 mL/10 g,腹腔注射角叉菜膠溶液的體積為0.1 mL/10 g。造模12 h 后根據小鼠黑尾程度計算黑尾率,黑尾率(%)=小鼠黑尾部分長度/小鼠尾全長×100%

        2.1.3 爵床活性部位的成分檢測 稱取RPE 50 mg 置于10 mL 量瓶中,以一定量的乙腈超聲30 min 使之溶解,冷卻后用乙腈定容,充分搖勻,0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液進樣檢測。

        液相分析采用Eclipse XDB-C18色譜柱;以水(A)-乙腈(B)作為流動相,梯度洗脫(0 ~8 min,45%B;8 ~12 min,45%~65%B;12 ~20 min,65%B;20 ~25 min,65%~45%B);流速0.6 mL·min-1;柱溫30℃;紫外檢測波長256 nm;進樣量10 μL。

        2.1.4 爵床活性部位化學成分的分離純化 用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱進一步從 RPE 中制備單體化合物。乙腈溶解RPE 樣品,流動相為50%乙腈,等度洗脫,柱溫30℃,流速4 mL·min-1,紫外檢測波長 256 nm。將5 個色譜峰的溶液對應收集后,濃縮并回收溶劑,干燥。

        2.2 體外的爵床活性物質抗血小板聚集實驗

        2.2.1 爵床活性物質的細胞毒性實驗 取新西蘭兔耳緣靜脈處血,收集到含3.8%枸櫞酸鈉的真空采血管中,得抗凝血液。將其在1800 g 下離心10 min 后取上清液,為富血小板血漿(PRP)。下層液體用1800 g 離心18 min 后取上清液制備貧血小板血漿(PPP),將PRP 調整為3.5×108個·mL-1,與空白溶劑、PRE 溶液(0.25 ~4.00 mg·mL-1)、爵床脂定B(JDB)溶液(0.05 ~0.80 mg·mL-1)、金不換甲醚(CME)溶液(0.06 ~0.96 mg·mL-1)分別在37℃下孵育10 min,然后500 g 離心10 min 后,取上清液,試劑盒檢測各組LDH 含量。同時直接將PRP 離心,取上清液測血小板的總LDH 含 量。計算LDH 釋放率,LDH 釋放率(%)=待測樣品LDH 含量/總LDH 含量×100%

        2.2.2 血小板黏附實驗 將圓形蓋玻片清洗干凈后放至24 孔板中,每孔加入200 μL 的COL(5 μg·mL-1)或1% BSA 溶液對照,4℃過夜后吸出包被液,加入200 μL 的1% BSA 溶液,封閉60 min 后棄去液體,用1×PBS 液清洗3 次,每孔加入200 μL“2.2.1”項下制備好的PRP,各濃度的藥液以及空白溶劑同樣分別加200 μL 復方丹參片(55.0 mg·mL-1)、ASP(2.0 mg·mL-1)、JDB(0.20 mg·mL-1)、CME(0.24 mg·mL-1)、RPE-L(低濃度,0.25 mg·mL-1)、RPE-M(中濃度,0.50 mg·mL-1)、RPE-H(高濃度,1.0 mg·mL-1)溶液,37℃孵育90 min,之后吸棄培養(yǎng)液并漂洗3 次,用4%的多聚甲醛溶液固定20 min,棄去液體并漂洗3 次,以羅丹明鬼筆環(huán)肽250 μL 避光染色30 min 后吸棄染色劑。用熒光顯微鏡在暗室觀察,熒光染色百分比通過Image pro plus 6.0 軟件計算。單體化合物JDB 和CME 的給藥濃度計算由兩者在RPE 中的含量換算而來。

        2.2.3 體外抗血小板聚集率的測定 待血小板聚集儀測試孔中的溫度達37℃,將PPP 和PRP置入測量杯中,以PPP 為對照,透光率調節(jié)為100%,然后取下PPP,將PRP 放入,向PRP 加入空白溶劑或各溶度的藥物(濃度與“2.2.2”項下一致),反應5 min,透光率調節(jié)為0%,加入ADP、THR、COL 3 種不同的誘導劑使其與血小板結合,進而使血小板聚集,濁度下降,透光率上升,即可測得血小板聚集率。讀取300 s 內的血小板最大聚集率。

        2.3 體內的爵床活性物質抗血小板聚集實驗

        2.3.1 大鼠尾血栓模型實驗 實驗分為9 組,模型組和溶劑組灌胃0.5%的CMC-Na 溶液,ASP(2.0 mg·mL-1)、復方丹參片(570 mg·kg-1)、JDB(4.2 mg·kg-1)、CME(5.1 mg·kg-1)、RPE-L(低劑量,5.0 mg·kg-1)、RPE-M(中劑量,10.0 mg·kg-1)、RPE-H(高劑量,20.0 mg·kg-1)組以對應濃度藥液灌胃,不間斷灌胃7 d,每日一次,最后一次給藥前12 h 停止喂食,自由飲水,并且于給藥后1 h 造模。溶劑組腹腔注射等量的生理鹽水,模型組和各濃度給藥組每只以0.5 mL/100 g 的0.4%角叉菜膠溶液腹腔注射造模。造模12 h 后觀察各組大鼠尾部的血栓情況,計算黑尾率;以7%水合氯醛將大鼠麻醉后,通過腹主動脈取血8 mL,取其中6 mL 與抗凝劑混勻后離心,剩余2 mL 不加抗凝劑,待凝固后離心,取上層液即為血清。并計算肝系數,肝系數(%)=大鼠肝質量/大鼠體質量×100%

        2.3.2 體內給藥抑制血小板聚集率實驗 將“2.3.1”項下得到的抗凝血用“2.2.1”項下方法得到PRP 和PPP,按“2.2.3”項下方法檢測血小板聚集率。

        2.4 Western blot 實驗

        將PRP 低速離心,獲得血小板沉淀物??偟鞍滋崛〔捎肦IPA 裂解緩沖液。樣品用SDSPAGE 電泳分離,轉至NC 膜上,將NC 膜與一抗在4 ℃下孵育過夜,然后用TBST 洗膜3 次,每次10 min。洗滌后,用HRP 抗偶聯二抗孵育1 h。以相同的方式清洗膜。用FluorChem FC3 系統進行顯影。

        2.5 統計學分析

        用SPSS 19.0 軟件分析,統計結果使用單因素方差分析,并以均值±標準差表示。P<0.05認為差異具有統計學意義。

        3 結果

        3.1 爵床活性部位篩選情況

        如圖1,溶劑組黑尾率為0,且小鼠尾部未形成血栓,模型組和給藥組都有血栓形成。與模型組相比,給藥各組黑尾率都顯著下降(P<0.05),且C1組黑尾率最低,說明C1組的抗血小板聚集作用最強,因此將C1組作為活性部位(即RPE),進行后續(xù)研究。

        3.2 活性部位成分分析結果

        通過HPLC 檢測,并與對照品色譜峰對比,最終確定RPE 中的5 個潛在活性成分分別為6'-羥基爵床脂定B(6'-OH-JDB,1,純度:97.23%)、爵床脂定B(JDB,2,純度:96.50%)、金不換甲醚(CME,3,純度:98.18%)、新爵床脂定B(NJDB,4,純度:96.08%)和新爵床脂定A(NJDA,5,純度:95.45%)。圖2為HPLC 色譜圖,圖3 為化合物對應的結構式。

        3.3 爵床活性物質對細胞毒性研究

        根據LDH 釋放率可知,血小板經過不同濃度的PRE 處理后,各濃度PRE 的LDH 釋放率與溶劑組相比無明顯差異(P>0.05),不同濃度的JDB 組和CME 組與溶劑組相比無明顯差異(P>0.05),證明RPE、JDB 和CME 對血小板幾乎無毒性,其抗血小板活性可能不是由于對血小板的毒性引起的(見圖4)。

        3.4 爵床活性物質的抗血小板黏附作用

        由圖5 可知,溶劑組幾乎無血小板黏附,而模型組有大量的血小板黏附;與模型組相比,給藥組的血小板黏附量減少(P<0.05,P<0.01),且RPE 的高劑量組以及復方丹參組、ASP 組的血小板黏附量最少,抗黏附作用最強,而RPE 低、中劑量組,JDB 組及CME 組抗黏附作用較ASP組弱,RPE 低劑量組作用最弱。

        3.5 爵床活性物質體外抗血小板聚集的作用

        誘導劑為凝血酶的情況下,與溶劑組比較,各給藥組血小板聚集率(除RPE 低劑量組和CME組)都有所下降(P<0.05,P<0.01),而RPE高劑量組和ASP 組的血小板聚集率最低,對血小板聚集的抑制作用最強;誘導劑為ADP 時,與溶劑組比較,各給藥組均能顯著降低血小板聚集率(P<0.05,P<0.01),且RPE 高劑量組對血小板聚集率降低效果最明顯;誘導劑為COL 時,與溶劑組比較,各給藥組(除RPE 低劑量組)血小板集率都有所下降(P<0.05,P<0.01),且RPE高劑量組與復方丹參組、ASP 組的血小板聚集率更低,而CME 抗血小板聚集的作用較弱(見圖6)。

        3.6 爵床活性物質對大鼠尾血栓模型的保護作用

        圖1 各組小鼠尾血栓(a)和黑尾率(b)比較Fig 1 Tail thrombus(a)and black tail rate(b)of mice in each group of mice

        圖2 RPE 的HPLC 色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of RPE

        圖3 化合物1 ~5 的結構式Fig 3 Chemical structure for compound 1 ~5

        圖4 不同濃度的RPE(a)、JDB(b)及CME(c)的LDH 釋放率Fig 4 LDH release rate of RPE(a),JDB(b)and CME(c)at different concentrations

        圖5 各給藥組對血小板黏附的作用(A)及熒光染色情況(B)Fig 5 Effect of each administration group on platelet adhesion(A)and fluorescence staining(B)

        溶劑組大鼠在造模12 h 后尾部沒有形成血栓,而模型組和給藥組的大鼠尾部均有血栓形成。與模型組相比,給藥組大鼠的黑尾率均有所下降(P<0.05,P<0.01)。同時發(fā)現模型組大鼠的肝臟腫脹、肝臟系數增高。而給藥組的大鼠肝臟系數與模型組對比均顯著降低(P<0.05),說明所給藥物能夠減輕肝臟腫脹,降低炎癥反應,如圖7所示。

        圖6 不同誘導劑對血小板聚集率的作用Fig 6 Effect of different inducer on platelet aggregation rate

        圖7 藥物對大鼠黑尾率(a)和肝系數(b)的影響Fig 7 Effect of drug on rat black-tail rate(a)and liver coefficient(b)

        3.7 爵床活性物質對ADP、COL、THR 誘導的體內血小板聚集的作用

        與溶劑組相比,模型組的血小板聚集率顯著提高(P<0.01);當誘導劑是THR 和COL時,與模型組對比,RPE 高劑量組、復方丹參組、ASP 組、JDB 組血小板聚集率顯著降低(P<0.05),說高劑量 的RPE,以 及ASP 和JDB 具有抗凝血酶、抗膠原誘導的血小板聚集的作用;而誘導劑是ADP 時,RPE 低劑量組與模型組對比無顯著性差異(P>0.05),其他各給藥組對血小板聚集率均有降低作用(P<0.05),結果見圖8。

        圖8 不同誘導劑對大鼠血小板聚集率的作用Fig 8 Effect of different inducer in each administration group on platelet aggregation rate in rats

        圖9 大鼠血小板中β3 蛋白的表達情況Fig 9 Expression of beta 3 protein in rat platelets

        3.8 爵床活性物質對角叉菜膠誘導的大鼠體內β3蛋白的影響

        如圖9 所示,與溶劑組比較,模型組尾血栓大鼠的血小板中β3蛋白表達量顯著增高(P<0.01);與模型組對比;ASP 組,RPE 高、中、低劑量組均能顯著下調β3蛋白的表達(P<0.05,P<0.01),而JDB 組 和CME 組 對β3蛋白的影響不明顯。

        4 討論

        在止血過程中血小板有很重要的作用,但血小板在異常時會形成血栓,進而誘發(fā)炎癥以及動脈粥樣硬化等病情[11-14]。相關研究認為針對血小板異常的靶向治療有助于緩解血管疾病,但當前抗血小板藥物對患者療效有限,且具有一定毒副作用[15],例如長期使用阿司匹林會導致胃出血,因此有必要研究更加安全有效的抗血小板藥物[16]。

        小鼠尾血栓實驗結果表明中C1組分(RPE)具有較好的抗尾血栓活性。通過HPLC 分析發(fā)現其由5 種木脂素類化合物組成,分別是CME、6'-OH-JDB、NJDB、JDB 和NJDA[17-19];通過制備液相色譜法,獲得這5 種單體成分。JDB 和CME在活性部位中含量最高,是抗血小板聚集的主要活性物質,因此選擇這兩種化合物和RPE 進行后續(xù)研究[20-21]。

        藥物的毒性考察結果表明,LDH 釋放率均在3%以下,表明爵床活性物質對血小板沒有明顯的細胞毒性。

        體外實驗中,采用比濁法研究了爵床活性物質對APP、THR 和COL 3 種誘導劑誘導的兔血小板聚集的抑制作用。發(fā)現爵床中的活性物質能有效抑制血小板聚集。體內實驗中,采用角叉菜膠大鼠尾血栓模型,同樣用上述3 種誘導劑誘導大鼠的血小板聚集,研究體內條件下藥物對血小板聚集的影響。結果顯示爵床活性物質表現出很好的體內抗血小板聚集作用。

        誘導劑激活血小板后,會促使膜蛋白整合素αⅡbβ3活化,與纖維蛋白結合,形成血小板聚集。整合素αⅡbβ3由兩個Ⅰ型跨膜糖蛋白αⅡb和β3通過二硫鍵連接而成。而血小板表面整合素β3作為主要受體影響血小板聚集并促進血栓形成[22]。實驗結果證實了爵床活性物質可以下調尾血栓大鼠體內的β3蛋白的表達,表明其抗血小板聚集的作用機制與下調整合素β3有關。

        綜上所述,本實驗首次在體內外兩個層面闡釋了爵床活性物質RPE、JDB、CME 的抗血小板藥效,并初步研究了爵床抗血小板機制與降低整合素β3的表達有關,為進一步深入探討爵床抗血小板聚集作用機制提供了理論支撐,為爵床資源的開發(fā)提供幫助。

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