潘虹 余小霞 普艷紅 袁瑞仙

乳腺癌是一種常見的女性惡性腫瘤，具有很高的發(fā)病率，在我國，乳腺癌在女性惡性腫瘤中排第三位，嚴(yán)重危害著女性的身體健康[1]。臨床上雖然可通過手術(shù)治療，但是由于乳腺癌本身的發(fā)病原因多樣，涉及到的分子機(jī)制復(fù)雜，導(dǎo)致乳腺癌患者的長期生存率以及治療預(yù)后并不理想[2]。相關(guān)研究表明非編碼小分子RNA(microRNA，miRNA)是一類由19～22個(gè)核苷酸組成的小分子RNA，其可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因發(fā)揮促癌或者抑癌作用，與腫瘤密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲等過程中至關(guān)重要[3,4]。其中miRNA-135a是定位于 3號染色體的miRNA-135 家族的重要組成成員，相關(guān)研究表明miRNA-135a在腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5,6]。此外，同源框基因 HOXA10是胚胎發(fā)育過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增生與分化。本研究將以MCF-7乳腺癌細(xì)胞作為模型細(xì)胞，探討miRNA-135a對于乳腺癌細(xì)胞HOXA10表達(dá)的調(diào)控以及該作用對于乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集2017年5月至2018年3月于我院就診的58例乳腺癌患者癌組織及距離癌組織>2 cm 處的正常組織，經(jīng)組織病理學(xué)檢測證實(shí)為乳腺癌。所有入選患者在術(shù)前均未進(jìn)行放化療和其他治療，且臨床病理資料完整。58例乳腺癌患者，年齡25～65歲，平均年齡(40.73±12.37)歲；TNM分期：Ⅰ期患者20例，Ⅱ期患者12例，Ⅲ期患者18例，Ⅳ期患者8例；腫瘤直徑<5 cm患者22例，≥5 cm患者36例；組織學(xué)分級：中高分化患者46例，低分化患者12例；共有36例發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有患者同意本研究并簽署知情同意書，且經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)后收集標(biāo)本。

1.2 試劑與儀器 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購自上海中科院細(xì)胞庫；miRNA-135a mimic以及miRNA-135a購買于GeenPharma; 胎牛血清購自Biowest公司；四甲基偶氮唑藍(lán) (methyl thiazolyltetrazolium，MTT)購自Sigma公司；結(jié)晶紫，ECL Plus 超敏發(fā)光液，RPMI1640培養(yǎng)基、考馬斯亮藍(lán)試劑購自北京索萊寶公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine、TRIzol試劑盒購買于Invitrogen公司；RIPA 裂解液I、HOXA10一抗及β-actin購于一抗購于英國Abcam公司，山羊血清以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購買于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，美國)；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)；高速離心機(jī)(Eppendorf，德國)；冷凍冷藏兩用冰箱(Siemens，德國)；轉(zhuǎn)膜儀以及電泳儀(北京六一儀器廠),倒置顯微鏡(Olympus,日本)。

1.3 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測mi-RNA-135a以及HOXA10的表達(dá) 采用TRIzol試劑重懸，反復(fù)吹打充分裂解細(xì)胞，之后根據(jù)試劑說明書提取總RNA并對RNA濃度及純度進(jìn)行檢測。根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性60 s;60℃ 退火30 s;72℃延伸50 s，共40個(gè)循環(huán)，每組重復(fù)3次。其中miRNA-135a以U6作為每次擴(kuò)增的內(nèi)參，HOXA10以β-actin作為內(nèi)參，采用ABI 7500對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。見表1。

表1 引物序列

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng) 采用RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合抗生素溶液)在37℃、5%的CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞MCF-7。每3天對細(xì)胞進(jìn)行傳代1次。取處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細(xì)胞消化。構(gòu)建miRNA-135a的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，取 3 μg miRNA-135a的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒以及慢病毒表達(dá)空質(zhì)粒分別和 8 μg Packaging Mix加入RPMI1640培養(yǎng)基中，輕輕混勻后加入 20 μl的Endo FectinTM-Lenti 轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育 30 min。將混合物緩慢加入到MCF-乳腺癌細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8及平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 將上述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別按每孔5×103個(gè)/孔鋪于12孔板，每組4個(gè)孔分成三組，分為空白對照組(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、空載體組(轉(zhuǎn)染空載體)、miRNA-135a組(轉(zhuǎn)染miRNA-135a)，每周換液1次，培養(yǎng)2周后采用考馬斯亮藍(lán)染色，2周后用考馬斯亮藍(lán)染色，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)菌落形成數(shù)量，每組取平均值。分組如上，每組6個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞密度調(diào)整為 5×104個(gè)/ml后接種于96孔板(每孔100 μl)，培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μl的CCK-8溶液，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h 后，將96孔板置于多功能酶標(biāo)儀中檢測 450 nm 處的吸光度值。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 用10%胎牛血清的RPMI1640全培養(yǎng)基將上述細(xì)胞密度調(diào)整為 5×104個(gè)/ml后接種于12孔板，每孔加入1 ml細(xì)胞液，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h，細(xì)胞基本融合后，使用200 μl 槍頭在細(xì)胞層上制造劃痕，加入PBS洗3次以去除細(xì)胞碎片，孵育24 h后采用倒置顯微鏡觀測細(xì)胞遷移狀況。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 實(shí)驗(yàn)前12 h將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)基，消化細(xì)胞后用滅菌PBS清洗并計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)分組如上，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/ml，吸取200 L細(xì)胞懸液接種于 Matirge 膠預(yù)先包被好的 Transwell小室上室中，下室加入600 L含10% FBS，1%雙抗的 RPMI1640 培養(yǎng)基，確保Transwell下室與上室間無氣泡，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將小室取出，并用PBS洗滌2次，甲醇固定30 min，用棉簽將小室上層未遷移細(xì)胞輕輕擦掉，倒置晾干，用0.1%的結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下取5個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)。

1.8 生物信息學(xué)預(yù)測及熒光素酶基因報(bào)告分析 使用生物信息學(xué)網(wǎng)站StarBase預(yù)測miRNA-135a可互補(bǔ)結(jié)合的基因。通過miRBase數(shù)據(jù)庫獲得人的miRNA135a和HOXA10基因序列，以HNEC細(xì)胞基因組DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增HOXA10的3’-非翻譯區(qū)序列，構(gòu)建至熒光素酶報(bào)告基因載體psi-CHECK中，記為野生型HOXA10-wild，同時(shí)構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒HOXA10-mutant。將HEK293T細(xì)胞按30%左右密度鋪于24孔板，將miRNA-135a mimic、mimic control分別及上述質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，以空載質(zhì)粒作為對照。轉(zhuǎn)染后24 h，根據(jù)雙熒光素酶測定試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.9 qRT-PCR檢測 收集上述細(xì)胞各5×106個(gè)，采用TRIzol試劑重懸，反復(fù)吹打充分裂解細(xì)胞，之后根據(jù)試劑說明書提取總RNA并對RNA濃度及純度進(jìn)行檢測。根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性30 s;95℃變性60 s;60℃ 退火30 s;72℃延伸50 s，共40個(gè)循環(huán)，每組重復(fù)3次。以β-actin作為每次擴(kuò)增的內(nèi)參，采用ABI 7500對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。

1.10 Western blot檢測 分別收集上述細(xì)胞加入RIPA裂解液300 L裂解10 min，1 3000 r/min離心3 min 取上清。BCA蛋白定量試劑盒測定含量，每組分別上樣20 g蛋白樣本加上樣緩沖液后煮沸以制備蛋白樣品，100℃水浴變性3 min，采用10% SDS-PAGE分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋后的HOXA10一抗(1∶500)以及β-actin一抗(1∶500)，4℃搖床過夜孵育。次日復(fù)溫后用PBST將PVDF膜洗凈并加入適量稀釋好的HRP，37℃孵育2 h之后ECL顯影拍照，保存圖像，并用Image J 軟件分析條帶，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算HOXA10蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-135a以及HOXA10在乳腺癌組織中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，NSCLC組織中miRNA-135a的表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.05)，HOXA蛋白的表達(dá)量明顯低于正常組織(P<0.05)。見表2。

表2 miRNA-135a、HOXA10在不同組織中的相對表達(dá)量

2.2 乳腺癌組織中miRNA-135a的表達(dá)情況與患者臨床病理特征之間的關(guān)系 取miRNA-135a在乳腺癌組織中相對表達(dá)量差異倍數(shù)的中位數(shù)作為截點(diǎn)，將乳腺癌患者分為兩組，大于中位數(shù)為高表達(dá)組(n=38)、小于中位數(shù)為低表達(dá)組(n=20)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，miRNA-135a表達(dá)水平與患者腫瘤分化程度(P=0.008)、浸潤深度(P=0.009)、Her2狀態(tài)(P=0.008)、腫瘤分期(P=0.014)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.020)密切相關(guān)，而與其他臨床特征包括年齡(P=0.864)及腫瘤大小(P=0.813)無相關(guān)性。見表3。

表3 miRNA-135a表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 例(%)

2.3 miRNA-135a對于乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 與空白對照組比較，miRNA-135a組細(xì)胞克隆數(shù)以及細(xì)胞增殖率均有顯著增加 (P<0.05)，空載體組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 miRNA-135a對于乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 miRNA-135a對于乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響 miRNA-135a組細(xì)胞遷移率相比于空白對照組，有顯著升高(P<0.05)，空載體組與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表5。

圖1 miRNA-135a對于乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響；A 代表性劃痕實(shí)驗(yàn)照片；B 劃痕實(shí)驗(yàn)量化結(jié)果

表5 miRNA-135a對于乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

2.5 miRNA-135a對于細(xì)胞侵襲能力的影響 與空白對照組比較，miRNA-135a組細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)均有顯著增加(P<0.05)，空載體組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表6。

圖2 miRNA-135a對于乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響；A 代表性侵襲實(shí)驗(yàn)照片；B 侵襲實(shí)驗(yàn)量化結(jié)果

表6 miRNA-135a對于細(xì)胞侵襲能力的影響 個(gè),

2.6 生物信息學(xué)預(yù)測 使用StarBase預(yù)測軟件分析，結(jié)果顯示miRNA-135a與HOXA10具有最高的匹配預(yù)測值。證明miRNA-135a與HOXA10存在靶向結(jié)合位點(diǎn)；雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-135a后，HOXA10-wild的熒光素酶活性被抑制(P<0.05)，而HOXA10-mutant的熒光素酶活性無明顯變化，說明miR-135a與HOXA10具有靶向調(diào)控關(guān)系。見圖3，表7。

圖3 生物信息學(xué)預(yù)測miRNA-135a與HOXA10的關(guān)系

表7 miR-148a與 HOXA10雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果

2.7 HOXA10的mRNA轉(zhuǎn)錄水平 與空白對照組比較，miRNA-135a組HOXA10的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，空載體組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表8。

表8 HOXA10的mRNA表達(dá)水平

2.8 HOXA10的蛋白表達(dá)水平 miRNA-135a組細(xì)胞HOXA10蛋白表達(dá)相比于空白對照組，顯著降低(P<0.05)，空載體組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4，表9。

圖4 HOXA10蛋白表達(dá)水平；A 電泳轉(zhuǎn)膜后蛋白條帶圖片；B 蛋白表達(dá)水平量化結(jié)果

表9 HOXA10的蛋白表達(dá)水平

3 討論

乳腺癌是一種最為常見也最致命的女性惡性腫瘤疾病，嚴(yán)重影響全球女性的健康，其病因復(fù)雜，涉及因素眾多[7,8]。乳腺癌的發(fā)病過程具有多基因性，對此國內(nèi)外做了廣泛研究，目前研究表明BRCA-1、p53和 PTEN等基因與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，這些基因在一定程度上可用于預(yù)測乳腺癌[9,10]。乳腺癌中早期患者經(jīng)過治療有良好預(yù)后，對于晚期以及術(shù)后轉(zhuǎn)移而又復(fù)發(fā)的乳腺癌患者治療效果相當(dāng)差，5年生存率僅為20%左右[11,12]。造成乳腺癌患者死亡的主要原因癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲轉(zhuǎn)移[13]。因此，深入研究乳腺癌遷移、侵襲轉(zhuǎn)移過程的相關(guān)調(diào)控機(jī)制對于提高患者的預(yù)后至關(guān)重要。

miRNA是一種長度約為22 nt的非編碼RNA，其主要通過沉默特異性基因來發(fā)揮功能，某些miRNA可以通過降解mRNA從而抑制某些特定蛋白的合成，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控蛋白的表達(dá)。miRNA參與到多種疾病的生理、病理過程，對疾病的發(fā)生發(fā)展有顯著影響，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖以及凋亡等。近年來，miRNA在腫瘤發(fā)生以及發(fā)展進(jìn)程中起到的作用備受關(guān)注，某些miRNA可直接參與腫瘤的形成[14]。腫瘤的進(jìn)展涉及多種基因調(diào)控，過程復(fù)雜，miRNA的表達(dá)在其中發(fā)揮了重要作用，但關(guān)于miRNA發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚不清楚。miRNA-135a作為 miRNA-135家族成員之一，被廣泛報(bào)道參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如在非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌中，miRNA-135a可促進(jìn)其腫瘤細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮癌基因的作用，通過對miRNA-135a表達(dá)的抑制可促進(jìn)相關(guān)腫瘤的凋亡和抑制增殖[15,16]。此外，相關(guān)研究報(bào)道，乳腺癌組織中miRNA-135a呈高表達(dá)水平，暗示miRNA-135a可能與乳腺癌疾病的進(jìn)程息息相關(guān)[17]。HOX基因編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對于胚胎形成、形態(tài)發(fā)生和器官發(fā)育至關(guān)重要[18]。HOX基因家族包括HOXA、HOXB、HOXC以及HOXD，其中HOXA10曾被多次報(bào)道在宮頸癌、卵巢癌、肺癌中表達(dá)異常，表明它們可能與腫瘤的發(fā)展有著密切關(guān)系[19,20]。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HOXA10在人類乳腺組織細(xì)胞中表達(dá)，并且也有研究指出HOXA10可抑制癌基因的表達(dá)，由此可見，HOXA10具有一定的抑癌作用[21]。研究表明，miRNA 135a與HOXA10二者互補(bǔ)結(jié)構(gòu)高達(dá) 97%，證明HOXA10可能是miRNA 135a的靶基因[22]。因此，本研究通過構(gòu)建miRNA-135a過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系來體外探討miRNA 135a與HOXA10對于乳腺癌進(jìn)程的影響并驗(yàn)證二者之間的關(guān)系，相比于空白對照組，轉(zhuǎn)染miRNA-135a的MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲能力顯著增強(qiáng)。此外，轉(zhuǎn)染miRNA-135a的MCF-7乳腺癌細(xì)胞的HXOA10的mRNA與蛋白的表達(dá)水平明顯降低；與此同時(shí)，空載體組乳腺癌細(xì)胞的HOXA10的表達(dá)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示，miRNA-135促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的作用可能是通過抑制HOXA10蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究通過體外驗(yàn)證了mi-RNA-135a通過抑制HOXA10蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲能力。然而，細(xì)胞的遷移和侵襲是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，受眾多因素的調(diào)控。因此，這一過程的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。