周曉瑜， 常 杰， 王二曉， 張靜靜 ， 樊 蕊

(中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科， 陜西 西安 710032)

每年約有40萬人被確診為肺癌，外科手術(shù)仍是肺癌患者有效治療手段，但術(shù)后患者轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差，5年生存率約為15.6%[1]，根本原因?yàn)榉伟┰缙谠\斷和預(yù)后評(píng)估仍存在一定難度，因此積極探尋一種有效標(biāo)志物對(duì)肺癌預(yù)后評(píng)估和精準(zhǔn)治療有重要臨床意義。從分子生物學(xué)角度分析，肺癌發(fā)生與癌基因的激活以及抑癌基因失活等多種分子生物學(xué)變化密切相關(guān)，有學(xué)者證實(shí)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白2A(Cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)是惡性腫瘤患者體內(nèi)一個(gè)突變基因[2]，研究證實(shí)[3]CDKN2A基因產(chǎn)物屬于腫瘤抑制因子，其可參與細(xì)胞周期的調(diào)控并延緩細(xì)胞增殖，在干細(xì)胞粗細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮重要作用，文獻(xiàn)報(bào)道[4]CDKN2A基因失活與肝癌、非小細(xì)胞肺癌、食管鱗癌等惡性生物學(xué)行為有關(guān)，但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于CDKN2A基因在肺癌組織中表達(dá)及其與病理特征和預(yù)后關(guān)系的研究尚處于初步探索階段，為此本文旨在探究CDKN2A基因在肺癌組織中表達(dá)及其臨床意義，旨在為肺癌早期診治和預(yù)后評(píng)估提供參考，具體結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：收集2017年1月至2017年12月本院收治的81例肺癌患者臨床病理以及隨訪資料。①納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料及隨訪資料完善；經(jīng)穿刺活檢或影像學(xué)檢查診斷為肺癌；術(shù)前未接受放療或化療；不合并其他類型惡性腫瘤；標(biāo)本取材獲得患者知情同意書。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝腎等臟器功能障礙；預(yù)計(jì)生存期不足三個(gè)月；合并嚴(yán)重精神疾病。81例肺癌患者，男31例、女50例，年齡45～71[平均(62.05±5.17)]歲，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)21～25[平均(22.65±1.04)]kg/m2，分化程度：高分化20例、中分化46例、低分化12例，美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：Ⅰ期29、Ⅱ期41例、Ⅲ期11例，腺癌29例、鱗癌52例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：轉(zhuǎn)移51例、無轉(zhuǎn)移30例。經(jīng)患者及其家屬知情同意后，采集本院留存的81例肺癌患者石蠟包埋肺癌組織及其癌旁組織(距癌組織邊緣約2cm)標(biāo)本。本研究征得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(批準(zhǔn)文號(hào)：2017倫審論第012號(hào))。

1.2方法：①肺癌組織及其癌旁組織中CDKN2A免疫組織化學(xué)檢測(cè)：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法染色，組織切片經(jīng)脫蠟水處理后，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，進(jìn)一步經(jīng)抗原修復(fù)，隨后滴入一抗(CDKN2A一抗)和二抗(采用DAB顯色試劑)，標(biāo)本經(jīng)DAB顯色處理后，進(jìn)行染色處理，同時(shí)經(jīng)脫水和透明處理，最后封片。CDKN2A免疫組化陽性判斷[5]：每次鏡下觀察均取5個(gè)高倍視野，以平均值為最終結(jié)果，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色染色顆粒表示陽性。分別計(jì)算陽性細(xì)胞占比[<5%為0分，6%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分]和染色強(qiáng)度[無色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分]，總分為兩者均數(shù)乘積，>6分為高表達(dá)組，<6分為低表達(dá)組。②肺癌組織及其癌旁組織中CDKN2A mRNA測(cè)定：提取所有標(biāo)本的總RNA，行擴(kuò)增，第一顯子序列：上游：5'-ACC CTG TCC CTC AAA TCC TC-3'，下游：5'-TGG CTC CTC ATT CCT CTT CCT T-3'；第二外顯子基因序列：5'-CAT CTA TGC GGG CAT GGT TA-3；下游序列：5'-TGC AGC ACC ACC AGC GTG TC-3'；內(nèi)參物：上游序列： 5'-CGG GAA ATC GTG CGG AC-3；下游：5'-TCG CTC CAA CCG ACT GCT-3'。總反應(yīng)體系25μL(包含RNA模板4μL，上下游引物各2μL，2Tap PCR MasterMix 12μL，剩余為雙蒸水)預(yù)處理5min后(95℃)、72℃(30s)、退火時(shí)間為30s，退火溫度分別設(shè)置為60℃、61℃、59℃，共行30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增完畢后開展葡聚糖凝膠電泳，系統(tǒng)自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析CDKN2A的mRNA表達(dá)量，每個(gè)樣本都重復(fù)3次并取平均Ct值，相對(duì)定量采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt，對(duì)肺癌癌組織及其癌旁組織中CDKN2A mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。③標(biāo)本組織中CDKN2A的蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)：應(yīng)用Western blotting檢測(cè)癌組織及其癌旁組織中CDKN2A蛋白表達(dá)情況，首先收集CDKN2A蛋白樣品，測(cè)定蛋白樣品蛋白濃度，采用SDS-PAGE凝膠試劑盒配制SDS-PAGE凝膠，在所收集到的蛋白樣品中滴加適量SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，在100℃熱水中加熱，對(duì)蛋白充分變性后使其冷卻后，室溫將蛋白樣品上樣到SDS-PAGE凝膠加樣孔中，采用SDS-PAGE電泳液進(jìn)行電泳，在電泳時(shí)將溴酚藍(lán)送至膠底端處附近即可停止電泳，采用Bio-Rad標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作(電流設(shè)為300～400mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間設(shè)為30～60min)，轉(zhuǎn)膜時(shí)應(yīng)用多功能電泳儀，快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，最后將蛋白膜置于預(yù)先備好的洗滌液中進(jìn)行漂洗，經(jīng)一抗、二抗孵育后，回收二抗，加洗滌液，總共洗滌3次，采用BeyoECL pLUS試劑檢測(cè)蛋白。④預(yù)后隨訪：復(fù)診或電話形式進(jìn)行隨訪，以患者手術(shù)當(dāng)日為隨訪起點(diǎn)，隨訪截止日期(2019年12月)或患者死亡時(shí)間為終點(diǎn)。

1.3觀察指標(biāo)：①肺癌組織及其癌旁組織中CDKN2A免疫組化結(jié)果分析。②肺癌組織及其癌旁組織中CDKN2A mRNA表達(dá)量比較。③CDKN2A與肺癌患者病理參數(shù)的關(guān)系分析。④肺癌組織中CDKN2A表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的分析，依據(jù)肺癌患者癌組織中CDKN2A表達(dá)高低分為CDKN2A高表達(dá)組、CDKN2A低表達(dá)組，對(duì)比兩組患者預(yù)后生存情況。

2 結(jié) 果

2.1肺癌組織及其癌旁組織中CDKN2A免疫組化結(jié)果分析:肺癌組織中CDKN2A表達(dá)率明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1和圖1。

圖1 肺癌組織及其癌旁組織中CDKN2A免疫組化染色情況

圖a為肺癌癌組織中CDKN2A低表達(dá)(400×)，圖2b為肺癌癌旁組織中CDKN2A高表達(dá)(400×)

表1 肺癌組織及其癌旁組織中CDKN2A免疫組化結(jié)果分析n(%)

2.2肺癌組織及其癌旁組織中CDKN2A mRNA表達(dá)量比較:肺癌癌組織CDKN2A mRNA相對(duì)表達(dá)量、CDKN2A蛋白相對(duì)表達(dá)量較癌旁組織明顯低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。肺癌及其癌旁組織中CDKN2A蛋白電泳結(jié)果顯示有兩條分別為65/39ku的電泳條帶(對(duì)應(yīng)為CDKN2A及內(nèi)參照β-珠蛋白條帶)，如圖2所示。

表2 肺癌組織及其癌旁組織中CDKN2A mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 肺癌組織及其癌旁組織中CDKN2A蛋白電泳

其中a、c、e、g為肺癌癌旁組織，b、d、f為肺癌癌組織，CDKN2A在肺癌癌旁組織中表達(dá)高，肺癌組織中CDKN2A蛋白表達(dá)量較癌旁組織低

2.3CDKN2A與肺癌患者病理參數(shù)的關(guān)系分析:分化程度高、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移肺癌患者CDKN2A表達(dá)率明顯高于分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 CDKN2A與肺癌患者病理參數(shù)的關(guān)系分析

2.4肺癌組織中CDKN2A表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的分析:81例肺癌患者均隨訪至術(shù)后2年，其中CDKN2A表達(dá)組、CDKN2A低表達(dá)組各有3例刪失(均因失訪或隨訪期間因其他疾病所致死亡而刪失)，隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)入組患者術(shù)后2年生存率為69.33%(52/75)，CDKN2A表達(dá)組術(shù)后2年生存率100.00%(8/8)明顯高于CDKN2A低表達(dá)組65.67%(44/67)(Log-rank χ2=5.024，P<0.05)，見圖3。

圖3 不同CDKN2A表達(dá)的肺癌患者預(yù)后情況

3 討 論

肺癌是目前全球范圍內(nèi)病死率較高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病及預(yù)后與癌基因激活以及抑癌基因失活，導(dǎo)致細(xì)胞從正常表型轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒员硇偷壬飳W(xué)行為有關(guān)，近期大量文獻(xiàn)研究表明CDKN2A基因失活參與多種腫瘤發(fā)生和進(jìn)展，如王鑫等[6]研究發(fā)現(xiàn)CDKN2A基因缺失會(huì)導(dǎo)致CDK2/4/6激活，促進(jìn)胰腺癌腫瘤生長(zhǎng)及增殖，梅新宇[7]文獻(xiàn)報(bào)告指出CDKN2A基因甲基化可能是食管鱗癌發(fā)生的早期分子事件，或與食管鱗癌的惡性程度密切相關(guān)，國(guó)外學(xué)者研究則證實(shí)CDKN2A基因失活與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)[8]。而CDKN2A基因失活與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的主要機(jī)制有：有效抑制RNA聚合酶活性，改變細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合[9]?；诖耍e極分析CDKN2A基因在肺癌組織中表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系，或可為肺癌早期診治提供參考。

本研究結(jié)果顯示：肺癌組織CDKN2A表達(dá)率明顯低于癌旁組織，肺癌組織CDKN2A mRNA相對(duì)表達(dá)量、CDKN2A蛋白相對(duì)表達(dá)量較癌旁組織明顯低，由此說明CDKN2A在肺癌患者中呈明顯下調(diào)趨勢(shì)，與方紅等[10]研究大體上相符。近期國(guó)外學(xué)者Xande J G等[11]一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CDKN2A基因與 p53基因能夠在體外和體內(nèi)協(xié)同發(fā)揮殺傷人肺癌細(xì)胞的作用，而本結(jié)果還顯示分化程度高、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移肺癌患者CDKN2A表達(dá)率明顯高于分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示CDKN2A表達(dá)水平越高肺癌患者分化程度越高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越低，由此推測(cè)CDKN2A基因?qū)儆趷盒阅[瘤的一種有效抑癌基因，明確其在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，有望為肺癌患者的新型靶向抗腫瘤藥物的研制提供參考。此外，本研究結(jié)果還顯示入組患者術(shù)后2年總體隨訪生存率為69.33%(52/75)，較以往研究[12]報(bào)道76.3%低，或與本研究樣本量較小導(dǎo)致結(jié)果存在一定偏倚有關(guān)，另外本研究還發(fā)現(xiàn)CDKN2A高表達(dá)組術(shù)后2年生存率100.00%明顯高于CDKN2A低表達(dá)組65.67%，由此證實(shí)了CDKN2A基因表達(dá)與肺癌患者預(yù)后密切相關(guān)，CDKN2A基因表達(dá)越高患者預(yù)后愈佳，主要是因?yàn)镃DKN2A基因可作為腫瘤細(xì)胞周期抑制劑，通過CDKN2A-鼠雙微體2(MDM2)-腫瘤細(xì)胞P(P53)以及CDKN2A-周期蛋白依賴性激酶4/6(CDK4/6)-視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)兩條途徑，繼而有效調(diào)控腫瘤進(jìn)展，且其蛋白產(chǎn)物屬于一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，生物學(xué)作用包含：可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用，同時(shí)有效抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)，最終影響端粒酶的活性，最終有效抑制細(xì)胞的增殖作用[13]。因而CDKN2A基因表達(dá)情況與腫瘤病理特征和預(yù)后密切相關(guān)，表現(xiàn)為CDKN2A表達(dá)高低直接影響患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)以及預(yù)后。

綜上所述，本文雖初步證實(shí)了CDKN2A表達(dá)與肺癌患者病理特征和預(yù)后密切相關(guān)，但關(guān)于其具體機(jī)制還未完全明確，加之本研究樣本量較少，研究結(jié)果或存在一定偏倚，未來還需進(jìn)一步完善研究。