張宏偉， 王彩茹 ， 繆國(guó)東， 張化玉

(河北省承德市中心醫(yī)院普外科， 河北 承德 067000)

肝門(mén)部膽管癌是起源于膽管上皮細(xì)胞惡性腫瘤。肝門(mén)部膽管癌惡性度極高，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤(rùn)，且早期診斷率低。肝門(mén)部膽管癌對(duì)放、化療不敏感，目前對(duì)肝門(mén)部膽管癌治療的主要方法是手術(shù)切除，但切除率較低，且術(shù)后易復(fù)發(fā)。膽管癌患者預(yù)后差，主要原因是膽管癌早期發(fā)展過(guò)程中發(fā)生周?chē)窠?jīng)浸潤(rùn)[1]。文獻(xiàn)報(bào)告，膽管癌細(xì)胞可侵入周?chē)窠?jīng)叢發(fā)生神經(jīng)浸潤(rùn)，從而發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3(Muscarinic acetylcholine receptor M3，CHRM3)屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，是乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)受體。膽管周?chē)窠?jīng)遞質(zhì)的分泌對(duì)膽管癌神經(jīng)浸潤(rùn)具有促進(jìn)作用。范帥等[3]研究發(fā)現(xiàn)膽管癌神經(jīng)浸潤(rùn)可能是通過(guò)激活CHRM3來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究采用免疫組化法檢測(cè)CHRM3在肝門(mén)部膽管癌組織中表達(dá)情況，并探討CHRM3與肝門(mén)部膽管癌預(yù)后的關(guān)系，旨在明確CHRM3對(duì)評(píng)估患者預(yù)后方面的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2013年1月至2017年4月本院收集的手術(shù)切除的69例肝門(mén)部膽管癌組織及69例膽管癌癌旁正常膽管組織為研究對(duì)象。其中男性44例，女性25例；年齡50～75歲，平均年齡(58.37±8.16)歲；病理分期：Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期44例；病理分級(jí)：低、中分化42例，高分化27例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例；有神經(jīng)浸潤(rùn)41例，無(wú)神經(jīng)浸潤(rùn)28例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①癌組織經(jīng)專(zhuān)家鑒定均為肝門(mén)部膽管癌病理組織，病理組織符合肝門(mén)部膽管癌鑒定標(biāo)準(zhǔn)[4]；②首次患肝門(mén)部膽管癌；③患者臨床資料完整，術(shù)后配合完成此試驗(yàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)其它惡性腫瘤患者；②曾經(jīng)接受過(guò)放化療患者；③肝、腎功能?chē)?yán)重異常患者；④有凝血功能障礙患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)?；颊呒爸毕涤H屬對(duì)本研究知情，并簽訂知情同意書(shū)。

1.2主要試劑及儀器:CHRM3抗體(批號(hào)：bs-4918R-2)購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(批號(hào)：170-6516)購(gòu)自深圳市安提生物科技有限公司；SPCC-200型生物顯微鏡購(gòu)自東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司；RM2016型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司。

1.3研究方法

1.3.1免疫組化法檢測(cè)肝門(mén)部膽管癌組織及癌旁組織中CHRM3表達(dá)水平:肝門(mén)部膽管癌組織及癌旁組織先用10%甲醛固定，再用石蠟包埋，然后切片。切厚度約3～4μm的切片。使用二甲苯對(duì)切片進(jìn)行脫蠟，然后在80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇分別進(jìn)行洗脫2min，待切片無(wú)水乙醇干燥后，加入鼠抗人CHRM3抗體作為一抗，4℃冰箱過(guò)夜，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗三次，再滴加羊抗鼠二抗，進(jìn)行37℃孵育40min，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。微鏡下觀察拍照鏡片結(jié)果。用試劑盒提供的陽(yáng)性的病理切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

1.3.2結(jié)果判定:每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由三位專(zhuān)業(yè)人員獨(dú)立判斷評(píng)定。置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。CHRM3表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性表達(dá)為淺黃色、棕黃色或褐色顆粒。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度，陽(yáng)性強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。任意選擇3～5個(gè)高倍鏡視野下(×400)陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行計(jì)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分(細(xì)胞數(shù)<5%)；1分(細(xì)胞數(shù)為5%～25%)；2分(細(xì)胞數(shù)為26%～50%)；3分(細(xì)胞數(shù)>51%)。根據(jù)染色指數(shù)(即染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的評(píng)分乘積)大小將免疫組化結(jié)果進(jìn)行等級(jí)劃分：0分代表為陰性(-)，1～4分代表為弱陽(yáng)性(+)，5～8分代表陽(yáng)性(++)，9～12分代表強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。其中0～4記為陰性表達(dá)，≥5分記為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4隨訪:對(duì)所有肝門(mén)部膽管癌患者均接受常規(guī)隨訪，隨訪時(shí)間3年，術(shù)后第一年內(nèi)每隔4個(gè)月讓患者入院復(fù)查一次，術(shù)后第2、3年，每半年讓患者入院復(fù)查一次，并每3個(gè)月對(duì)患者進(jìn)行電話(huà)隨訪，記錄肝門(mén)部膽管癌患者生存死亡情況。本次隨訪截止日期為2020年4月30日，死亡患者以死亡時(shí)間作為隨訪截止日期。

2 結(jié) 果

2.1CHRM3在肝門(mén)部膽管癌組織上的表達(dá)水平:CHRM3陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)呈棕黃色或褐色顆粒。CHRM3在癌旁組織和肝門(mén)部膽管癌組織陽(yáng)性率分別為7.25%和84.06%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 CHRM3在肝門(mén)部膽管癌旁組織和癌組織中表達(dá)(HE染色，×200，箭頭表示肝門(mén)部膽管組織染色區(qū)域)

圖2 CHRM3表達(dá)與肝門(mén)部膽管癌患者生存率的關(guān)系

2.2CHRM3表達(dá)水平與肝門(mén)部膽管癌臨床病理特征的關(guān)系:肝門(mén)部膽管癌組織中CHRM3表達(dá)水平與年齡、性別無(wú)關(guān)(P>0.05)，與病理分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤(rùn)有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3CHRM3表達(dá)水平與肝門(mén)部膽管癌患者生存率的關(guān)系:Kaplan-Meier法顯示CHRM3陰性肝門(mén)部膽管癌患者平均生存時(shí)間為(33.69±0.76)個(gè)月，顯著長(zhǎng)于CHRM3陽(yáng)性肝門(mén)部膽管癌患者(23.37±1.02)個(gè)月(t=5.029，P=0.025)。見(jiàn)圖2。

表1 CHRM3在肝門(mén)部膽管癌組織及癌旁組織中表達(dá)水平n(%)

表2 CHRM3表達(dá)水平與肝門(mén)部膽管癌臨床病理特征的關(guān)系n(%)

表3 影響肝門(mén)部膽管癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

2.4影響肝門(mén)部膽管癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析:單因素分析表明，病理分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤(rùn)、CHRM3陽(yáng)性均是影響肝門(mén)部膽管癌患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素分析表明，神經(jīng)浸潤(rùn)、CHRM3陽(yáng)性是影響肝門(mén)部膽管癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.020，95% CI為1.574～2.593；HR=2.303，95% CI為1.259～3.468，P均<0.05)。見(jiàn)表3。

3 討 論

膽管癌包括肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌。肝門(mén)部膽管癌發(fā)生于神經(jīng)纖維外部，神經(jīng)浸潤(rùn)是其癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的獨(dú)立的形式[5]。膽管癌細(xì)胞神經(jīng)浸潤(rùn)方式主要為神經(jīng)周?chē)g隙內(nèi)生長(zhǎng)，其次為神經(jīng)纖維內(nèi)彌漫性生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤主病灶區(qū)無(wú)神經(jīng)纖維分布，但在腫瘤由肝門(mén)部膽管壁向周?chē)M織浸潤(rùn)生長(zhǎng)后，易發(fā)生腫瘤神經(jīng)浸潤(rùn)。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移與神經(jīng)遞質(zhì)及其受體密切相關(guān)[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞可沿神經(jīng)突觸向神經(jīng)節(jié)遷移生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞的遷移具有方向性[7]。CHRM簡(jiǎn)稱(chēng)M受體，是一種單鏈跨膜糖蛋白，由460～590個(gè)氨基酸組成，在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的腺體分泌、平滑肌收縮等中具有重要作用[8]。CHRM3是M受體中的一種，是參與分泌液體的外分泌腺細(xì)胞的G蛋白偶聯(lián)受體，由七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成，在外分泌腺、神經(jīng)和血管平滑肌等不同的器官系統(tǒng)中均有表達(dá)[9,10]。CHRM3在多種腫瘤細(xì)胞中具有表達(dá)，且可與多種信號(hào)通路相連，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用?；罨蟮腃HRM3能激活下游的mRNA，進(jìn)而調(diào)控不同信號(hào)通路，促使細(xì)胞發(fā)揮不同的功能。Vasamsetti等[11]研究顯示，結(jié)腸癌組織中檢測(cè)到CHRM3過(guò)度表達(dá)，其表達(dá)較正常結(jié)腸組織增加了2～128倍，CHRM3的活化促進(jìn)了結(jié)腸癌胞的增殖、侵襲和遷移。大多數(shù)來(lái)源于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的癌細(xì)胞可合成和釋放乙酰膽堿，扮演著自分泌和旁分泌生長(zhǎng)因子角色，可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。Felton等研究顯示[12]在結(jié)腸癌中，CHRM3活化可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移。肝臟由交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)共同支配，這些神經(jīng)來(lái)源于圍繞門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈和膽管的內(nèi)臟神經(jīng)和迷走神經(jīng)。在肝癌中發(fā)現(xiàn)，肝臟受迷走神經(jīng)支配，迷走神經(jīng)可釋放神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，乙酰膽堿能夠與肝癌細(xì)胞上CHRM3結(jié)合，使CHRM3活化，活化的CHRM3可激活其下游磷酯酰肌醇-3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[13]。關(guān)于CHRM3，在前期研究中發(fā)現(xiàn)[14]膽管周?chē)置诘纳窠?jīng)遞質(zhì)會(huì)誘發(fā)膽管癌神經(jīng)浸潤(rùn)，而膽管周?chē)置诘纳窠?jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用主要依靠CHRM3。本研究發(fā)現(xiàn)CHRM3在癌旁組織陽(yáng)性率顯著低于肝門(mén)部膽管癌組織陽(yáng)性率，提示CHRM3可能與肝門(mén)部膽管癌發(fā)生有關(guān)。病理分析發(fā)現(xiàn)肝門(mén)部膽管癌組織中CHRM3表達(dá)水平與年齡、性別無(wú)關(guān)，與病理分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤(rùn)有關(guān)，提示CHRM3可能影響肝門(mén)部膽管癌病情發(fā)展，猜測(cè)CHRM3可能通過(guò)促進(jìn)肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞神經(jīng)浸潤(rùn)發(fā)生從而促進(jìn)病情發(fā)展。Kaplan-Meier法顯示CHRM3陰性肝門(mén)部膽管癌患者平均生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于CHRM3陽(yáng)性肝門(mén)部膽管癌患者，多因素分析表明，神經(jīng)浸潤(rùn)、CHRM3陽(yáng)性是影響肝門(mén)部膽管癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示CHRM3陽(yáng)性患者可能易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)，對(duì)該部分患者在治療和術(shù)后恢復(fù)中應(yīng)及時(shí)發(fā)現(xiàn)、治療，避免不良預(yù)后。綜上所述，CHRM3在肝門(mén)部膽管癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率顯著上升，與病理分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤(rùn)有關(guān)，有望成為肝門(mén)部膽管癌預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。但本研究中CHRM3參與肝門(mén)部膽管癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制有待進(jìn)一步探究。