吳林生 徐德聰

摘要 以藍(lán)莓為原料，研究不同因素對(duì)藍(lán)莓酵素發(fā)酵的影響，以確定最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)。研究紅糖添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間以及添加酵母菌種類4個(gè)因素對(duì)藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的影響，并記錄發(fā)酵液pH的變化，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的色澤、氣味及滋味進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并以超氧化物歧化酶（SOD）活性、DPPH自由基清除能力為理化檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行分析，最終確定藍(lán)莓酵素發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)。藍(lán)莓酵素發(fā)酵加工的最優(yōu)工藝參數(shù)如下：藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的pH為4.5，藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1，發(fā)酵溫度為25 ℃，發(fā)酵時(shí)間為28 d，添加葡萄酒酵母時(shí)超氧化物歧化酶活性最高，DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，感官評(píng)分最高。

關(guān)鍵詞 藍(lán)莓;酵素;超氧化物歧化酶;DPPH自由基

中圖分類號(hào) TS255.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）07-0184-04

Abstract Taking blueberry as raw materials，the effects of different factors on the fermentation of blueberry enzymes were studied，the optimal fermentation process parameters were determined.The effects of four factors，namely the amount of brown sugar added，the fermentation temperature，the fermentation time and the addition of yeast strains，on the fermentation broth of? blueberry enzymes were studied，the pH changes of the fermentation broth were recorded.The sensory evaluation was made on the color，odor and taste of the fermentation products.The superoxide dismutase （SOD） activity and scavenging capacity of DPPH free radicals were used as physical and chemical indices for analysis.Finally，the optimum technology parameters for the fermentation of blueberry enzymes were determined.The research results showed that the optimum processing technology parameters for the fermentation of blueberry enzymes were as follows：pH of the blueberry enzyme fermentation broth was 45，the mass ratio of blueberry and brown sugar was 1∶1，the fermentation temperature was 25 ℃，the fermentation time was 28 days， wine yeast was added.Under the above processing technology parameters，SOD activity was the highest，DPPH free radical scavenging capacity was the strongest，the sensory score was the? best.

Key words Blueberry;Enzyme;Superoxide dismutase;DPPH free radicals

作者簡(jiǎn)介 吳林生（1984—），女，安徽合肥人，實(shí)驗(yàn)員，從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏研究。

藍(lán)莓為越橘屬植物，原產(chǎn)地為美國佛羅里達(dá)州，也稱為藍(lán)漿果，成熟后的果實(shí)接近圓形或者扁圓形，呈現(xiàn)藍(lán)紫色，外皮有一層白色果粉[1]。藍(lán)莓鮮果皮薄多汁、水分含量非常高，有“漿果之王”之稱，富含維生素、果酸和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還富含花青素以及原花青素等多酚類化合物與多糖類化合物，具有抗氧化、抗癌和抗炎作用，對(duì)慢性疾?。ㄈ缣悄虿?、肥胖癥以及骨質(zhì)疏松等）有益[2-3]，所以被國際糧農(nóng)組織稱為人類五大健康食品之一[4]。因此，近些年越來越多的人開始關(guān)注藍(lán)莓以及與藍(lán)莓相關(guān)的產(chǎn)品，也有越來越多的人開始種植藍(lán)莓。

酵素是一種近年來在日本以及中國臺(tái)灣地區(qū)非常流行的功能性食品。酵素主要是果蔬和可食用的藥材經(jīng)過可食用菌種在一定的條件下發(fā)酵而成的對(duì)人體有益的食用品[5]，這些食用品經(jīng)過益生菌發(fā)酵形成的各種代謝產(chǎn)物能夠有效調(diào)理以及促進(jìn)人體腸胃的消化吸收、增強(qiáng)人體的免疫力[6]。人體適當(dāng)攝取酵素可以延緩機(jī)體的衰老，也可以延長(zhǎng)人們的壽命[7]。酵素（enzyme）是指酵素菌在活動(dòng)中產(chǎn)生的各種活性物質(zhì)和酶，也統(tǒng)稱為酶。因其由天然酵素菌產(chǎn)生，無任何副作用等優(yōu)點(diǎn)，酵素深受人民群眾尤其是女性群體的喜愛[8-9]。

日本在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)掌握熟練相關(guān)的生產(chǎn)技術(shù)來制備酵素產(chǎn)品，島本覺也家族研制復(fù)合了24種有益菌，用于生產(chǎn)酵素及其各種衍生產(chǎn)品，其他國家（包括中國在內(nèi)）都沒有研究出超過10種的復(fù)合菌種[10]。國外酵素的應(yīng)用相對(duì)中國而言更加廣泛，發(fā)展水平也更高，在醫(yī)療、保健等領(lǐng)域更具代表性。從食品、保健角度來看，以蘆薈為例，國外研制出各式各樣的蘆薈發(fā)酵飲品以及保健產(chǎn)品，而國內(nèi)對(duì)蘆薈的使用主要集中在蘆薈本身的狀態(tài)上。從醫(yī)療保健角度來看，在國外酵素已被用于病毒類疾病、關(guān)節(jié)炎、癌癥、三高癥等疾病的治療，而國內(nèi)對(duì)蘆薈產(chǎn)品的研究尚處于初步研究階段。隨著酵素越來越被人們關(guān)注，國內(nèi)外各大酵素公司的競(jìng)爭(zhēng)也越來越激烈[11-12]。

作為近些年食品行業(yè)發(fā)展及關(guān)注的焦點(diǎn)，轉(zhuǎn)基因食品安全問題存在很大爭(zhēng)議，酵素的出現(xiàn)極大地促進(jìn)了食品及相關(guān)行業(yè)的發(fā)展，酵素食品及其相關(guān)產(chǎn)品很可能成為保健食品行業(yè)讓人追捧的對(duì)象之一[13]。

近些年，藍(lán)莓及其加工出來的各種衍生產(chǎn)品越來越受到人們的歡迎，如藍(lán)莓酒、藍(lán)莓醋、藍(lán)莓酸奶等。藍(lán)莓食用酵素作為一種新型的功能產(chǎn)品，能夠?qū)θ梭w的健康產(chǎn)生積極、有益的影響。筆者充分利用藍(lán)莓和酵素的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，研究藍(lán)莓食用酵素的加工工藝并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，探討制備高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的藍(lán)莓酵素產(chǎn)品的加工及優(yōu)化工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料。

藍(lán)莓、紅糖、面包酵母（食品級(jí)）。

1.1.2 試劑。無水乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、鄰苯三酚，均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程[14-15]。工藝流程如圖1所示。

1.2.2 藍(lán)莓酵素最優(yōu)發(fā)酵工藝條件試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

藍(lán)莓常溫解凍，紅糖紫外滅菌45 min，藍(lán)莓按比例與紅糖混合密封裝罐，并用標(biāo)簽標(biāo)記。以超氧化物歧化酶（SOD）活性、DPPH自由基清除能力為檢測(cè)指標(biāo)，在其他條件不變的情況下，分別考察藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、酵母菌種類對(duì)藍(lán)莓發(fā)酵液試驗(yàn)結(jié)果的影響。具體水平的設(shè)置根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可做適當(dāng)變動(dòng)。藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比分別設(shè)置為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間35 d，不添加酵母菌進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)藍(lán)莓發(fā)酵液的影響：發(fā)酵溫度分別設(shè)置21、23、25、27、29 ℃，藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1，發(fā)酵時(shí)間35 d，不添加酵母菌進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.2.2

發(fā)酵時(shí)間對(duì)藍(lán)莓發(fā)酵液的影響。發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)置7、14、21、28、35、42 d，藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1、發(fā)酵溫度25 ℃，不添加酵母菌進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.2.3 酵母菌種類對(duì)藍(lán)莓發(fā)酵液的影響。分別不用酵母和用葡萄酒酵母（1 g）、面包酵母（1 g）發(fā)酵，藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間35 d進(jìn)行發(fā)酵[16]。

1.2.3 藍(lán)莓酵素發(fā)酵液pH測(cè)定。每隔7 d取一定量的發(fā)酵液置于燒杯中，用精密pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 發(fā)酵液DPPH自由基清除能力的測(cè)定。每隔7 d取1 mL發(fā)酵液，稀釋30倍，過濾，取濾液待用。

用移液管量取0.02 mg/mL的DPPH-乙醇溶液8? mL置于試管中，加入8? mL樣品，搖晃混勻，在25 ℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，測(cè)定溶液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度。空白組用無

水乙醇代替測(cè)定溶液，測(cè)定吸光度。按照以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率（%）：

DPPH自由基清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%

式中，A1為樣品溶液的吸光度，A2為用無水乙醇代替DPPH時(shí)測(cè)得對(duì)應(yīng)濃度的本底吸光度，A0為空白組的吸光度。

1.2.5 發(fā)酵液超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定。

1.2.5.1 鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定。

用移液管量取0.1 mol/L Tris-HCl 4.5 mL 緩沖液置于試管中，加入去離子水4.2 mL，置于25 ℃水浴鍋中預(yù)熱20 min，加入0.3 mL經(jīng)25 ℃預(yù)熱的鄰苯三酚，快速搖晃混勻，開始計(jì)時(shí)，空白管為10 mmol/L HCl溶液，在420 nm波長(zhǎng)下自反應(yīng)30 s，以30 s為一次間隔，測(cè)定吸光度，總測(cè)定時(shí)長(zhǎng)為4 min。

1.2.5.2 樣品酶活性的測(cè)定。每隔7 d取1? mL發(fā)酵液，稀釋30倍后過濾，取濾液待用。

用移液管量取0.1 mol/L Tris-HCl 4.5 mL 緩沖液置于試管中，加入去離子水3.9 mL 、發(fā)酵液0.3 mL，置于25 ℃水浴鍋中預(yù)熱20 min，加入0.3 mL經(jīng)25 ℃預(yù)熱的鄰苯三酚，快速搖晃，開始計(jì)時(shí)，空白管為10 mmol/L HCl溶液，在420 nm波長(zhǎng)下自反應(yīng)30? s，以30 s為1次間隔，測(cè)定吸光度，總測(cè)定時(shí)長(zhǎng)為4 min。按照以下公式計(jì)算酶活性：

酶活性（U）=[（A-B）/A]/50%×反應(yīng)總體積×（樣品稀釋倍數(shù)/樣液體積）

式中，A為鄰苯三酚自氧化速率，B為發(fā)酵液抑制鄰苯三酚自氧化速率[17-20]。

1.2.6 藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的感官評(píng)價(jià)。

將試驗(yàn)所得的藍(lán)莓酵素發(fā)酵液進(jìn)行色澤、氣味及滋味感官評(píng)價(jià)，并記錄評(píng)分。感官評(píng)價(jià)由10位身體健康的實(shí)驗(yàn)室小組成員根據(jù)表1進(jìn)行評(píng)分，每項(xiàng)取10人評(píng)分的平均值，最后綜合取色澤、氣味和滋味的平均值，平均分取整數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓酵素發(fā)酵液pH的變化

每隔7 d取一定量的藍(lán)莓與紅糖（質(zhì)量比為1∶1），發(fā)酵溫度25 ℃，不添加酵母菌發(fā)酵的藍(lán)莓酵素發(fā)酵液置于燒杯中，用校準(zhǔn)過的精密pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的pH在開始14 d變化較大，pH由6.3變?yōu)?.4，此后趨于緩和，pH基本在4.5上下浮動(dòng)，可見藍(lán)莓酵素在發(fā)酵初期發(fā)酵速度較快，14 d后發(fā)酵速度趨于緩慢。pH的下降可能是由于有機(jī)酸濃度在發(fā)酵過程中有所增加，pH的升高可能是由于蛋白質(zhì)被微生物水解以及氨基酸被利用所致。

2.2 不同因素對(duì)藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的影響

2.2.1 藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵液DPPH自由基清除率和超氧化物歧化酶活性的影響。將藍(lán)莓與紅糖的質(zhì)量比分別設(shè)置為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間35 d，不添加酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見圖3。

從圖3可以看出，當(dāng)藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1時(shí)，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的DPPH自由基清除率最高（95.52%），抗氧化性能最好，加入的紅糖量過高時(shí)會(huì)影響發(fā)酵液DPPH自由基清除率。

從圖4可以看出，當(dāng)藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1時(shí)，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的超氧化物歧化酶活性最高，達(dá)到68.71 U/mL，此后隨著紅糖量的增加，超氧化物歧化酶活性有所降低。因此，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的藍(lán)莓與紅糖的最佳質(zhì)量比為1∶1。

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液DPPH自由基清除率和超氧化物歧化酶活性的影響。

將發(fā)酵溫度分別設(shè)置為21、23、25、27、29 ℃，藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1，發(fā)酵時(shí)間35 d，不添加酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見圖5。

從圖5可以看出，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液發(fā)酵初期時(shí)隨發(fā)酵溫度的增加，DPPH自由基清除率逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到最高值（95.52%），此后發(fā)酵溫度的增加抑制了藍(lán)莓酵素的發(fā)酵，DPPH自由基清除率逐漸下降。

從圖6可以看出，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液發(fā)酵初期時(shí)隨發(fā)酵溫度的增加，超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，超氧化物歧化酶活性達(dá)到最高值（68.71 U/mL），此后發(fā)酵溫度的增加抑制了藍(lán)莓酵素的發(fā)酵，超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。因此，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的最適發(fā)酵溫度為25 ℃。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液DPPH自由基清除率和超氧化物歧化酶活性的影響。

發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)置7、14、21、28、35、42 d，藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1、發(fā)酵溫度25 ℃，不添加酵母菌進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。

從圖7可以看出，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液發(fā)酵初期隨發(fā)酵時(shí)間的增加，DPPH自由基清除率逐漸升高;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到28 d時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)到最高值（96.79%）;此后，隨發(fā)酵時(shí)間的增加，DPPH自由基清除率逐漸下降。

從圖8可以看出，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液發(fā)酵初期時(shí)隨發(fā)酵時(shí)間的增加，超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為28 d時(shí)，超氧化物歧化酶活性達(dá)到最高值（69.23 U/mL），此后隨發(fā)酵時(shí)間的增加，超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。

因此，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的最適發(fā)酵時(shí)間為28 d。

2.2.4 不同酵母菌對(duì)發(fā)酵液的影響。

分別不用酵母、用葡萄酒酵母（1 g）和面包酵母（1 g）進(jìn)行發(fā)酵，藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間35 d，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，添加葡萄酒酵母處理發(fā)酵液DPPH自由基清除率最高，添加面包酵母處理次之，不用酵母處理最低;添加葡萄酒酵母處理超氧化物歧化酶活性處理最低，添加面包酵母次之，不用酵母最高。

由此可見，當(dāng)添加酵母發(fā)酵時(shí)藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的DPPH自由基清除率比不添加酵母發(fā)酵時(shí)高，當(dāng)添加葡萄酒酵母發(fā)酵時(shí)DPPH自由基清除率最高，達(dá)到97.26%。

當(dāng)添加酵母發(fā)酵時(shí)，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的超氧化物歧化酶活性比不添加酵母發(fā)酵時(shí)高，其中當(dāng)添加葡萄酒酵母發(fā)酵時(shí)超氧化物歧化酶活性最高，達(dá)到70.22 U/mL。因此，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液可以添加葡萄酒酵母進(jìn)行發(fā)酵。

2.3 藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的感官評(píng)價(jià) 將試驗(yàn)所得的藍(lán)莓酵素發(fā)酵液進(jìn)行色澤、氣味及滋味感官評(píng)價(jià)，并記錄評(píng)分。10位小組成員分別對(duì)藍(lán)莓酵素發(fā)酵液進(jìn)行感官評(píng)分，平均分?jǐn)?shù)取整數(shù)，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，從藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比來看，當(dāng)藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1時(shí)平均得分最高（9分），當(dāng)藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為3∶1時(shí)平均得分最低（5分）;從添加酵母菌種類來看，添加葡萄酒酵母時(shí)平均得分最高（10分），而添加葡萄酒酵母和不添加酵母時(shí)平均得分均為9分;從發(fā)酵溫度來看，發(fā)酵溫度25 ℃時(shí)平均得分最高（9分），發(fā)酵溫度21 ℃時(shí)平均得分最低（6分）;從發(fā)酵時(shí)間來看，發(fā)酵時(shí)間28 d時(shí)平均得分最高（9分），發(fā)酵時(shí)間7 d時(shí)平均得分最低（5分）。由此可見，當(dāng)藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1，添加葡萄酒酵母，發(fā)酵溫度為25 ℃，發(fā)酵時(shí)間為28 d時(shí)，藍(lán)莓酵素發(fā)酵液感官評(píng)價(jià)的綜合評(píng)分最高。

3 結(jié)論

筆者分別研究了藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、發(fā)酵溫度（21、23、25、27、29 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（7、14、21、28、35、42 d）、添加酵母菌種類（不添加酵母、葡萄酒酵母、面包酵母）4個(gè)因素對(duì)藍(lán)莓酵素發(fā)酵液的影響，并記錄發(fā)酵液pH的變化，對(duì)試驗(yàn)所得發(fā)酵產(chǎn)品的色澤、氣味及滋味進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并結(jié)合超氧化物歧化酶（SOD）活性、DPPH自由基清除率為理化檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行分析，最終確定藍(lán)莓酵素發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)：發(fā)酵液pH最終穩(wěn)定在4.5左右，當(dāng)藍(lán)莓與紅糖質(zhì)量比為1∶1、發(fā)酵溫度為25 ℃、發(fā)酵時(shí)間為28 d、添加葡萄酒酵母時(shí)超氧化物歧化酶活性最高，DPPH自由基清除率最高，感官評(píng)分也最高。

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