孟令波 孫婷婷 趙倩 胡寶忠

摘要 [目的]克隆CsGPX基因并研究其與黃瓜抗病性的關(guān)系。[方法]采用RT-PCR技術(shù)克隆黃瓜CsGPX基因cDNA序列全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;采用熒光定量PCR的方法分析CsGPX基因在細(xì)菌性角斑病侵染0～96h下的表達(dá)情況。[結(jié)果]CsGPX基因cDNA序列全長(zhǎng)914bp，包含一個(gè)513bp的開(kāi)放閱讀框，編碼170個(gè)氨基酸，該基因編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為19.02kD，理論等電點(diǎn)是8.66，為親水性蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)，不含信號(hào)肽序列。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，CsGPX在黃瓜葉中有表達(dá)。在黃瓜細(xì)菌性角斑病菌侵染下，該基因在黃瓜葉中表達(dá)增高，明顯受黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的誘導(dǎo)。[結(jié)論]CsGPX基因的分子鑒定為進(jìn)一步解析該基因在黃瓜抗病機(jī)制方面的作用提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黃瓜;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶;基因克隆;細(xì)菌性角斑病;熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào) S.436.421文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2021）07-0099-04

Abstract[Objective]TocloneCsGPXgeneandstudytherelationshipbetweenCsGPXgeneanddiseaseresistanceofcucumber.[Method]TheCsGPXgenecDNAfulllengthsequencewasclonedbyRT-PCRtechnology.CharacteristicsincludingthephysicochemicalpropertiesandconserveddomainofthededucedCsGPXproteinweredeterminedbyaseriesofbioinformaticstools.qRT-PCRtechnologywasperformedtomeasurethetranscriptlevelsofCsGPXgeneinducedbyP.syringaepv.Lachrymans.[Result]ThefulllengthnucleotidesequenceofCsGPXwas914bp，containingacompleteopenreadingframeof513bpwhichencodedapolypeptideof170aminoacids.Bioinformaticsanalysisoftheaminoacidsequenceshowedthatthemolecularweightofencodedproteinwas19.02kD，andtheoreticalisoelectricpointwas8.66.Thisproteinwasahydrophilicprotein，withouttransmembraneandsignalpeptidesequence.TheexpressionanalysesofthegenebyqRT-PCRshowedthattheCsGPXexpressdinCucumberleaves.InducedbyP.syringaepv.Lachrymans，thetranscriptlevelsofCsGPXincucumberleavesremarkablyincreasedwiththeextensionofinductiontime.[Conclusion]ThisstudylaidafoundationforprovidingimportantbasisforCsGPXgeneondiseaseresistancemechanismofcucumber.

KeywordsCucumber;Glutathioneperoxidase;Genecloning;Pseudomonassyringaepv.Lachrymans;RealtimefluorescencequantitativePCR

作者簡(jiǎn)介 孟令波（1970—），男，黑龍江哈爾濱人，副教授，博士，從事蔬菜遺傳育種與土壤微生物研究。*通信作者，教授，博士，從事植物學(xué)和植物分子生物學(xué)研究。

植物是好氧的生物體，在呼吸和光合作用過(guò)程中，線(xiàn)粒體、葉綠體和過(guò)氧化物酶體均可導(dǎo)致活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的產(chǎn)生，尤其在外界環(huán)境脅迫下，活性氧含量大大增加[1]。為了避免ROS過(guò)量積累所造成的損傷，植物細(xì)胞內(nèi)的防御系統(tǒng)（包括酶促和非酶促解毒系統(tǒng)）發(fā)揮了重要的作用。其中，酶促系統(tǒng)主要包括過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等[2-3]。其中，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathioneperoxidase，GPX）是機(jī)體內(nèi)清除活性氧自由基的主要酶類(lèi)，起到保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫的作用，具有重要的生理功能[4]。人們對(duì)GPX的認(rèn)識(shí)最早從動(dòng)物開(kāi)始，1957年，Mills[5]在提取哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞中的酶試驗(yàn)H2O2反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的。由于哺乳動(dòng)物中的GPX利用谷胱甘肽（GSH）為電子供體還原H2O2及有機(jī)氫過(guò)氧化物等，故GPX名稱(chēng)由此而來(lái)。相比之下，人們對(duì)植物GPX的研究開(kāi)始較晚。第一個(gè)植物GPX的cDNA最早是從煙草中獲得[6]，后來(lái)相繼在擬南芥[7]、水稻[8]、番茄[9]、菠菜[10]、小麥[11]、茶樹(shù)[12]等植物中分離到GPX基因。近年來(lái)，對(duì)于植物GPXs的研究主要集中在生物脅迫（感染細(xì)菌、真菌或病毒）和非生物脅迫（如高溫、低溫、干旱、重金屬毒害、耐鹽等）方面。在生物脅迫條件下，RoeckelDrevet等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向日葵被一種霜霉?。≒lasmoparahalstedii）感染后，GPXs基因的表達(dá)豐度顯著增加;Saidi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，棗椰樹(shù)感染脆葉?。˙rittleleafdisease）后，GPXs基因的表達(dá)水平在患病的根、葉中顯著提高。這些研究結(jié)果表明，在植物應(yīng)對(duì)病害脅迫的過(guò)程中，GPXs基因可能發(fā)揮作用。

黃瓜細(xì)菌性角斑病于20世紀(jì)70年代在我國(guó)嚴(yán)重暴發(fā)，目前已是我國(guó)乃至世界上影響黃瓜生長(zhǎng)的重要病害之一[15]，發(fā)病率在30%～50%，嚴(yán)重時(shí)可使植株中下部葉片全部壞死。目前黃瓜與細(xì)菌性角斑病相互作用的分子機(jī)理仍不清楚。該研究利用黃瓜葉cDNA文庫(kù)數(shù)據(jù)獲得了CsGPX編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，并對(duì)該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其功能。在此基礎(chǔ)之上，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌不同時(shí)間誘導(dǎo)下CsGPX基因的表達(dá)模式進(jìn)行深入分析，以期為探求黃瓜的抗病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料試驗(yàn)中采用的黃瓜（CucumissativusL.）為抗病品種D0462，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院培育;細(xì)菌性角斑?。≒seudomonassyringaepv.Lachrymans）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院惠贈(zèng)。誘導(dǎo)試驗(yàn)在黃瓜3片真葉期開(kāi)展，用噴霧器將1×108CFU/mL菌懸液均勻噴至葉面密布水珠但不流動(dòng)為可。病原菌誘導(dǎo)0、8、24、48、72、96h后收集葉片，用無(wú)菌水沖洗3遍，濾紙吸干，迅速置于液氮中后于-80℃冰箱備用。

1.2方法

1.2.1黃瓜總RNA提取。

采用植物總RNA提取試劑盒提取黃瓜抗病品種D0462總RNA，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取總RNA后采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用核酸分析儀檢測(cè)RNA的純度和濃度。

1.2.2CsGPX全長(zhǎng)cDNA克隆。

根據(jù)前期所構(gòu)建的黃瓜葉片cDNA文庫(kù)[16]，篩選獲得谷胱甘肽過(guò)氧化酶GPX基因cDNA全長(zhǎng)序列并設(shè)計(jì)引物CF1、CR1（表1），以黃瓜cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（50μL）：2×PCRMix25μL，正反引物CF1、CR1（20μmol/L）各1μL，cDNA模板2μL，不足的部分用ddH2O補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min;94℃30s、57℃40s、72℃1min，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物送生物公司測(cè)序。

1.2.3序列分析。

使用NCBI中的開(kāi)放閱讀框（openreadingframe，ORF）程序查找序列的ORF。分析ORF編碼的氨基酸序列采用ExPASy服務(wù)器上的ProtParamtool軟件（http：∥www.expasy.ch/cgi-bin/protparam）。CsGPX蛋白跨膜區(qū)、信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析分別采用TMHMM（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Signalp5.0（http：∥www.cds.dtu.dk/services/signal.p/）。通過(guò)NCBI中CDD程序（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）對(duì)CsGPX氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。用Netphos3.1server（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）對(duì)CsGPX氨基酸序列進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)分析。分別用Plant-mPloc（http：∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）和psortprediction（https：∥www.psort.hgc.jp/form.html）對(duì)CsGPX進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。利用SOPMA（https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/sopma.html）對(duì)CsGPX氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，CsGPX三級(jí)結(jié)構(gòu)采用SWISS-model（https：∥swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)。

1.2.4熒光定量PCR分析。

采用qRT-PCR方法，對(duì)經(jīng)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌不同時(shí)間誘導(dǎo)下的CsGPX基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，分別提取侵染0、8、24、48、72、96h處理的黃瓜葉總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取2μLcDNA為模板，加入SYBRPremixExTaqTM（2×）10μL，具體按寶生物工程大連有限公司說(shuō)明書(shū)操作。在A(yíng)gilentMx3000P型核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)儀上進(jìn)行RT-PCR，用于定量PCR的CsGPX基因的特異性引物（CF-qRT、CR-qRT）及內(nèi)參引物（18S-F、18S-R）見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30s;94℃12s，56℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)，讀板溫度為81℃，擴(kuò)增完成后采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算[17]。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA的提取及檢測(cè)

提取黃瓜葉片總RNA，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，28SrRNA的亮度大約是18SrRNA的2倍，說(shuō)明黃瓜總RNA完整性較好;經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)得OD260/OD280比值為1.88，介于1.8～2.1，表明提取的RNA純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2CsGPX基因全長(zhǎng)cDNA的獲得

以黃瓜cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖2可知，在1000bp附近得到1條CsGPX基因的特異片段，與預(yù)期大小相符。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化、測(cè)序后得到長(zhǎng)度為914bp的序列。

2.3CsGPX全長(zhǎng)序列分析

根據(jù)CsGPX全長(zhǎng)測(cè)序結(jié)果，利用NCBI網(wǎng)站上的ORFFinder進(jìn)行開(kāi)放閱讀框查找，發(fā)現(xiàn)CsGPX的cDNA序列全長(zhǎng)914bp，其中包含513bp的開(kāi)放閱讀框，23bp的5′非翻譯區(qū)以及378bp的3′非翻譯區(qū)，編碼170個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA（圖3）。通過(guò)與擬南芥的GPXs家族成員比較，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)保守程度較高的特征結(jié)構(gòu)域分別為VNVASKCGYT、ILAFPCNQF、KWNFTKFL，同時(shí)這3個(gè)結(jié)構(gòu)域也是GPX的特征性基序。

2.3.1理化性質(zhì)分析。

通過(guò)Protparam對(duì)CsGPX進(jìn)行分析可知其分子式為C858H1341N223O257S4，相對(duì)分子質(zhì)量為19.02kD，等電點(diǎn)（pI）為8.66，不穩(wěn)定參數(shù)為24.23，蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定（標(biāo)準(zhǔn)：40以下為穩(wěn)定蛋白）。該蛋白中相對(duì)含量較多的氨基酸是Lys（10.0%，17個(gè)）、Leu（8.2%，14個(gè)）、Thr（7.6%，13個(gè)）?？偟膸ж?fù)電荷殘基（Asp+Glu）為19，總的帶正電荷殘基（Arg+Lys）為22。親水性平均系數(shù)為-0.369，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白，其脂肪系數(shù)為78.00。TMHMM2.0分析顯示CsGPX無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。Signalp5.0分析結(jié)果表明該蛋白無(wú)信號(hào)肽。將CsGPX與部分?jǐn)M南芥GPXs家族成員的理化性質(zhì)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示CsGPX與AtGPX4在編碼氨基酸個(gè)數(shù)、等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量、所帶正負(fù)電荷氨基酸的數(shù)量等方面均較相似（表2），因此可以推斷黃瓜CsGPX與AtGPX4可能具有相似的功能。

2.3.2保守結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位的分析。

通過(guò)NCBI中CDD程序?qū)sGPX氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果（圖4）顯示，該基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)具有典型的保守結(jié)構(gòu)域GSH_Peroxidase，屬于硫氧還原蛋白超家族（thioredoxin-likesuperfamily）。用Netphos3.1server對(duì)CsGPX氨基酸序列進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，潛在的磷酸化位點(diǎn)位于Ser、Thr和Tyr3個(gè)氨基酸上，其中Ser為8，Thr為6，Tyr為3，共17個(gè)磷酸化位點(diǎn)。分別用PlantmPloc和psortprediction進(jìn)行CsGPX的亞細(xì)胞定位，CsGPX可能在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、線(xiàn)粒體等位置。

2.3.3蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

利用SOPMA對(duì)CsGPX氨基酸序列進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示CsGPX是由無(wú)規(guī)則卷曲、α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈等組成，其中，無(wú)規(guī)則卷曲（41.18%）為主要結(jié)構(gòu)，無(wú)規(guī)則卷曲存在的部位往往與該蛋白質(zhì)分子維持空間構(gòu)象有著重要的聯(lián)系。

用SWISS-model對(duì)CsGPX的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。由圖5（A）可看出，CsGPX有4個(gè)α螺旋和6個(gè)β折疊，與植物中GPX的經(jīng)典結(jié)構(gòu)一致;圖5（B）中3個(gè)帶黃色標(biāo)記的是半胱氨酸位點(diǎn)，通過(guò)這個(gè)位置容易與氫過(guò)氧化物類(lèi)的底物相結(jié)合，從而消除機(jī)體內(nèi)過(guò)多的活性氧自由基。

2.4黃瓜CsGPX基因的表達(dá)特性分析

采用qRT-PCR方法分析經(jīng)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌誘導(dǎo)不同時(shí)間的CsGPX基因表達(dá)情況。結(jié)果如圖6所示，該基因在0～96h的表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高（0～24h）后降低（24～48h）再升高（48～96h）的變化趨勢(shì)。整體看，CsGPX基因受病原菌誘導(dǎo)后（8～96h）的表達(dá)量均高于對(duì)照，最高可達(dá)對(duì)照表達(dá)量的363.5倍。由此說(shuō)明，CsGPX基因明顯受黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的誘導(dǎo)，推測(cè)該基因可能參與黃瓜細(xì)菌性病害的防御，在抵御生物脅迫中發(fā)揮作用。

3討論與結(jié)論

GPXs是生物體內(nèi)至關(guān)重要的活性氧自由基清除劑，可催化谷胱甘肽（GSH）轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），將有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，同時(shí)也可以促進(jìn)H2O2的分解，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不遭受損害[18]。與動(dòng)物相比，對(duì)植物中GPX的研究起步較晚。有研究表明，GPX氨基酸序列攜帶的是一個(gè)半胱氨酸殘基，替代了動(dòng)物基因組GPX核苷酸UGA終止密碼子處插入的硒代半胱氨酸[19]，即植物中的GPX蛋白不含有硒。GPXs常作為植物抗逆指標(biāo)，用來(lái)反映植物的氧化脅迫傷害程度和評(píng)價(jià)該植物的抗逆能力。當(dāng)植物遭受病原菌侵染[13]、高鹽[20]、重金屬[21]、干旱[22]、低溫[23]等不同生物和非生物脅迫時(shí)，多數(shù)GPX的表達(dá)及活性會(huì)增強(qiáng)。目前，對(duì)植物GPXs的研究多集中在非生物脅迫中的功能作用。如煙草中過(guò)量表達(dá)NtGPX基因能夠減少活性氧導(dǎo)致的膜損傷，提高煙草的耐鹽性及抗凍性[24]。番茄中過(guò)表達(dá)LePHGPX基因可提高其耐高溫脅迫的能力[25]。而有關(guān)于GPXs在生物脅迫中的功能作用研究相對(duì)較少。

黃瓜細(xì)菌性角斑病是黃瓜的一類(lèi)重要細(xì)菌性病害，近年來(lái)，黃瓜細(xì)菌性角斑病幾乎遍布全國(guó)各個(gè)黃瓜產(chǎn)區(qū)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致整個(gè)溫室的黃瓜發(fā)病死亡，發(fā)病率達(dá)100%[26]。目前黃瓜細(xì)菌性角斑病以化學(xué)防治為主，然而化學(xué)防治一方面會(huì)給環(huán)境和人類(lèi)帶來(lái)危害，另一方面還會(huì)引起病原物的抗藥性，加重該病害防治的難度。因此，深入了解寄主植物與病原物的互作關(guān)系可為黃瓜細(xì)菌性角斑病的有效防治提供參考。

該研究通過(guò)對(duì)黃瓜CsGPX基因cDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行克隆和分析，獲得全長(zhǎng)cDNA序列914bp，包含一個(gè)513bp的開(kāi)放閱讀框，編碼170個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定。通過(guò)與擬南芥GPXs比較發(fā)現(xiàn)，CsGPX與擬南芥具有相似的典型保守結(jié)構(gòu)，無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，共有17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，一般來(lái)說(shuō)，氨基酸序列中的磷酸化位點(diǎn)越多，該蛋白越可能會(huì)發(fā)揮更多功能[27]。根據(jù)CsGPX的亞細(xì)胞定位可以推測(cè)該基因可能與光合作用、生理生化反應(yīng)、能量傳遞、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)。為進(jìn)一步了解CsGPX在黃瓜抗病方面的功能，深入分析細(xì)菌性角斑病菌侵染下黃瓜CsGPX基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)CsGPX的表達(dá)顯著提高，最高可達(dá)對(duì)照表達(dá)量的363.5倍，說(shuō)明該基因明顯受黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的誘導(dǎo)。該結(jié)果可為研究CsGPX基因在黃瓜抗病方面的功能以及解析黃瓜與病原物互作網(wǎng)絡(luò)提供重要依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]RODRIGUEZMILLAMA，MAURERA，RODRIGUEZHUETEA，etal.GlutathioneperoxidasegenesinArabidopsisareubiquitousandregulatedbyabioticstressesthroughdiversesignalingpathways[J].PlantJ，2003，36（5）：602-615.

[2]杜秀敏，殷文璇，趙彥修，等.植物中活性氧的產(chǎn)生及清除機(jī)制[J].生物工程學(xué)報(bào)，2001，17（2）：121-125.

[3]苗雨晨，白玲，苗琛，等.植物谷胱甘肽過(guò)氧化物酶研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào)，2005，40（3）：350-356.

[4]FLOHL，GNZLERWA.Assaysofglutathioneperoxidase[J].MethodsEnzymol，1984，105（1）：114-121.

[5]MILLSGC.Hemoglobincatabolism：I.Glutathioneperoxidase，anerythrocyteenzymewhichprotectshemoglobinfromoxidativebreakdown[J].JBiolChem，1957，229（1）：189-197.

[6]CRIQUIMC，JAMETE，PARMENTIERY，etal.IsolationandcharacterizationofaplantcDNAshowinghomologytoanimalglutathioneperoxidases[J].PlantMolBiol，1992，18（3）：623-627.

[7]SUGIMOTOM，SAKAMOTOW.PutativephospholipidhydroperoxideglutathioneperoxidasegenefromArabidopsisthalianainducedbyoxidativestress[J].GenesGenetSyst，1997，72（5）：311-316.

[8]LIWJ，F(xiàn)ENGH，F(xiàn)ANJH，etal.MolecularcloningandexpressionofaphospholipidhydroperoxideglutathioneperoxidasehomologinOryzasativa[J].BiochimetBiophysActa（BBA）GeneStructExpr，2000，1493（1/2）：225-230.

[9]DEPEGEN，DREVETJ，BOYERN.MolecularcloningandcharacterizationoftomatocDNAsencodingglutathioneperoxidaselikeproteins[J].EurJBiochem，1998，253（2）：445-451.

[10]SUGIMOTOM，F(xiàn)URUIS，SUZUKIY.MolecularcloningandcharacterizationofacDNAencodingputativephospholipidhydroperoxideglutathioneperoxidasefromspinach[J].BiosciBiotechnolBiochem，1997，61（8）：1379-1381.

[11]張蕾，于永昂，張明霞，等.小麥GPX基因的克隆及植物表達(dá)載體構(gòu)建[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：31-34.

[12]劉賽，劉碩謙，龍金花，等.茶樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶編碼基因CsGPX1功能分析[J].茶葉科學(xué)，2019，39（4）：382-391.

[13]ROECKELDREVETP，GAGNEG，DELABROUHEDT，etal.Molecularcharacterization，organdistributionandstressmediatedinductionoftwoglutathioneperoxidaseencodingmRNAsinsunflower（Helianthusannuus）[J].PhysiolPlant，1998，103（3）：385-394.

[14]SAIDIMN，JBIRR，GHORBELI，etal.Brittleleafdiseaseinducesanoxidativestressanddecreasestheexpressionofmanganeserelatedgenesindatepalm（PhoenixdactyliferaL.）[J].PlantPhysiolBiochem，2012，50（1）：1-7.

[15]孫福在，何禮遠(yuǎn).黃瓜細(xì)菌性角斑病病原菌與寄主范圍鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，1988，18（1）：23-28.

[16]劉關(guān)君，王麗娟，秦智偉，等.黃瓜葉片細(xì)菌性角斑病侵染初期cDNA文庫(kù)分析[J].遺傳，2009，31（10）：1042-1048.

[17]LIVAKKJ，SCHMITTGENTD.AnalysisofrelativegeneexpressiondatausingrealtimequantitativePCRandthe2-ΔΔCTmethod[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[18]齊增園，陶鵬，李必元，等.白菜谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因GPX的鑒定與分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28（1）：64-69.

[19]ESHDATY，HOLLANDD，F(xiàn)ALTINZ，etal.Plantglutathioneperoxidases[J].PhysiolPlant，1997，100（2）：234-240.

[20]HOLLANDD，BENHAYYIMG，F(xiàn)ALTINZ，etal.Molecularcharacterizationofsaltstressassociatedproteinincitrus：ProteinandcDNAsequencehomologytomammalianglutathioneperoxidases[J].PlantMolBiol，1993，21（5）：923-927.

[21]NAVROTN，COLLINV，GUALBERTOJ，etal.Plantglutathioneperoxidasesarefunctionalperoxiredoxinsdistributedinseveralsubcellularcompartmentsandregulatedduringbioticandabioticstresses[J].PlantPhysiol，2006，142（4）：1364-1379.

[22]FERREIRANETOJRC，PANDOLFIV，GUIMARAESFC，etal.Earlytranscriptionalresponseofsoybeancontrastingaccessionstorootdehydration[J].PLoSOne，2013，8（12）：1-20.

[23]KIMYJ，JANGMG，NOHHY，etal.MolecularcharacterizationoftwoglutathioneperoxidasegenesofPanaxginsengandtheirexpressionanalysisagainstenvironmentalstresses[J].Gene，2014，535（1）：33-41.

[24]ROXASVP，LODHISA，GARRETTDK，etal.StresstoleranceintransgenictobaccoseedlingsthatoverexpressglutathioneStransferase/glutathioneperoxidase[J].PlantCellPhysiol，2000，41（11）：1229-1234.

[25]CHENSR，VAGHCHHIPAWALAZ，LIW，etal.TomatophospholipidhydroperoxideglutathioneperoxidaseinhibitscelldeathinducedbyBaxandoxidativestressesinyeastandplants[J].PlantPhysiol，2004，135（3）：1630-1641.

[26]陳璐.黃瓜細(xì)菌性角斑病菌和多主棒孢菌PCR檢測(cè)技術(shù)的建立[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

[27]周立敬，周宜君，高飛，等.擬南芥谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的生物信息學(xué)分析[J].中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，19（2）：11-17.