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        嗜熱棲熱菌發(fā)酵液延緩哀老及促進修復功效評價研究

        2021-04-29 16:13:24鄭雅方顏貴卉姚雨辰章鵬坤
        中國化妝品 2021年3期
        關鍵詞:發(fā)酵液培養(yǎng)液存活率

        鄭雅方 顏貴卉 姚雨辰 章鵬坤

        嗜熱棲熱菌具有促進細胞生長、延緩衰老、阻抗日光對皮膚的損害和修復皮膚的能力。本文采用高溫發(fā)酵制備嗜熱棲熱菌發(fā)酵液(Thermus thermoph.Ius fermentation broth),從細胞層面對其安全性、延緩衰老、防曬和創(chuàng)傷修復能力進行評價。結果表明,積分數(shù)≤10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對人永生化表皮細胞(HACAT)和人皮膚成纖維細胞(HSF)都是安全無毒的,并具有促進細胞增殖的作用;UVB光紫外照射損傷修復模型中,體積分數(shù)為1%~ 10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液均有較強的防曬能力和促進細胞生長能力,且具有延緩細胞衰老的功效;在細胞創(chuàng)傷修復模型中,體積分數(shù)為1%~ 10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液具有不同程度的創(chuàng)傷修復能力。上述結果表明嗜熱棲熱菌發(fā)酵液安全無毒,并具有一定的延緩衰老、防曬和創(chuàng)傷修復功效。

        隨著生物技術的飛速發(fā)展,微生物發(fā)酵原料被廣泛應用于化妝品領域,也有將其用于皮膚微生態(tài)的研究。將微生物高效應用制成的功能性化妝品(延緩衰老、美白、修復、保濕和輔助炎性皮膚改善等功效)受到人們青睞。一種生活在火山、深海熱巖等極端高熱環(huán)境下的嗜熱菌已成為人們日益重視并利用的微生物資源[1],嗜熱棲熱菌(ThermusThermophilus)廣泛分布于溫泉、地熱區(qū)土壤、海底火山口附近、廄肥等處[2],是一種耐熱菌,含有特異性的超嗜熱蛋白(如taqDNA聚合酶、耐熱淀粉酶、嗜熱蛋白酶、分子馬達等嗜熱酶),這些蛋白具有耐熱特性和強穩(wěn)定性,可以耐受90℃以上的高溫而不失活[3]。

        嗜熱棲熱菌中較為獨特的“生長因子”以核酸、維生素A、維生素82、煙酰胺、β類胡蘿卜素、谷胱甘肽、聚多氨(多聚氨基酸)等為主要成分,近年來,研究發(fā)現(xiàn)其還合有煙酰胺單核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide)等延緩衰老的活性物質。核酸是細胞代謝的必需物質,有助于表皮細胞基因的營養(yǎng)及其損傷的修復,對皮膚進行深層滋潤,使皮膚柔軟。維生素、谷胱甘肽、多聚氨為細胞生長因子,能夠恢復和促進細胞生理機能,在慢性、非治療傷口(如糖尿病潰瘍的傷口)修復時能夠促進細胞生長,還可以減輕皮膚炎癥反應和抵抗日光的損害。耐熱活性酶使嗜熱棲熱菌在高溫條件下仍具備超強的DNA保護與修復能力。利用該耐熱特性,K.B.Mullis將嗜熱菌中的taqDNA聚合酶應用開發(fā)了多聚酶鏈式反應,獲得了1993年的諾貝爾獎,基因工程研究也因此技術得以飛速發(fā)展[4]。LINTNERK等研究表明,在嗜熱菌體內提取到的一種對熱穩(wěn)定的酶可作為化妝品配方中維生素類活性成分的有效替代和補充,從而保護皮膚免受A型紫外線(UV-A)誘導生成自由基的損害[5]。相比于從植物中萃取和化學合成的方法將有效成分提取和分離,通過微生物發(fā)酵可產生大量活性成分(如透明質酸、氨基酸),發(fā)酵過程中還可能會伴隨某些成分的分解轉化而生成新的有效成分,從而發(fā)揮更佳的目標功能;并且從能源經濟角度來看,發(fā)酵法還是一種更加高效環(huán)保獲得的方法舊。

        本文利用高溫發(fā)酵制備嗜熱棲熱菌發(fā)酵液(Thermusthermophi[us fermentation broth),從體外細胞安全性、延緩衰老和修復功效等三個方面對發(fā)酵產物進行綜合評價,發(fā)掘其在延緩衰老和修復化妝品中的應用價值。

        01 材料與方法

        1.材料與儀器

        嗜熱棲熱菌發(fā)酵液(杭州優(yōu)瑪達生物科技有限公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(上海典瑞生物科技有限公司);RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司);0.25%胰酶,青一鏈霉素溶液(SK)(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司);噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(西格瑪奧德里奇中國有限公司);地塞米松(Dexamethasone)標準品,(IGC公司);人永生化表皮細胞(HACAT),人皮膚成纖維細胞(HSF)(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院);磷酸緩沖鹽溶液(PBS),現(xiàn)用現(xiàn)配,裝瓶滅菌待用;凈化工作臺(BT-ICD)(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋(XMTP203)(金壇市科析儀器有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(HF90)(上海力申科學儀器有限公司);低速立式離心機(KA-1000C)(上海安亭科學儀器廠);倒置顯微鏡(CKX31-12PHP)(杭州匯爾儀器設備有限公司);紫外線光療儀[SH4 (B) 1154T](上海希格瑪高技術有限公司);酶標儀(Mu[tiskan FC),[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司]。

        2.實驗方法

        (1)細胞培養(yǎng)

        將人永生化表皮細胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%SK的DMEM培養(yǎng)基,成纖維細胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%SK的RPMI 1640培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中,以0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液消化,將處于對數(shù)生長期的細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶,于37℃、5% CO2上進行培養(yǎng)。

        (2)嗜熱棲熱菌發(fā)酵液延緩衰老功效研究

        ①入永生化表皮細胞( HACAT)毒性的測定

        采用MTT法[7,8]檢測受試物對HACAT細胞存活率的影響。收集對數(shù)期細胞,用含10%FBS、1%SK的DMEM培養(yǎng)液制成HACAT細胞懸液,采用血球計數(shù)板計數(shù),用培養(yǎng)液調節(jié)細胞終濃度為IX104個/mL接種于96孔板中,于37℃、5% CO2下培養(yǎng),以不含細胞的培養(yǎng)液為空白調零組,板四周孔用無菌PBS填充封邊。待細胞貼壁生長至一定細胞個數(shù),換液加入不同體積分數(shù)(0.05%、0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%)的樣品,以不含樣品的培養(yǎng)液為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孑L加入20 mL MTT溶液(5g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液,每孔加100 mL DMSO,低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。選擇490 nm處在酶標儀上測定各孔吸光度值,記錄結果。

        ②人皮膚成纖維細胞(HSF)毒性的測定

        采用MTT法檢測受試物對HSF細胞存活率的影響。收集對數(shù)期細胞,用合10%FBS、1%SK的RPMI 1640培養(yǎng)液制成HSF細胞懸液,采用血球計數(shù)板計數(shù),用培養(yǎng)液調節(jié)細胞終濃度為ixi04個/mL接種200 mL/孑L96孔板中,于37℃、5% CO2下培養(yǎng),以不合細胞的培養(yǎng)液為空白調零組,板四周孔用無菌PBS填充封邊。待細胞貼壁生長至一定細胞個數(shù),換液加入不同體積分數(shù)(0.05%、0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%)的樣品,以不合樣品的培養(yǎng)液為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入20mL MTT溶液(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液,每孔加100 m[ DMSO,低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。選擇490 nm處在酶標儀上測定各孔吸光度值,記錄結果。按下式計算細胞存活率[10],用SPSS 16.O程序計算出IC50,并按表l判定毒性分級[11]:

        x(%)= (A藥物-A調零)× 100%

        (A對照-A調零)

        X(%)一細胞存活率;

        A藥物一加藥樣品測定孔的吸光度平均值;

        A調零一空白孔的吸光度平均值;

        A對照一對照孔的吸光度平均值;

        (3)嗜熱棲熱菌發(fā)酵液光損傷修復功效研究

        通過模擬的UVB光源照射HSF細胞建立光損傷修復模型后加入受試物,檢測受試物對光損傷細胞的修復能力。收集對數(shù)期細胞,用含10%FBS、1%SK的RPMI 1640培養(yǎng)液制成HSF細胞懸液,采用血球計數(shù)板計數(shù),用培養(yǎng)液調節(jié)細胞終濃度為5×104個/mL接種100 mL/孔96孔板中,于37℃、5%CO2下培養(yǎng),板四周子L用無菌PBS填充封邊。共接種2塊96孔板,每塊板設置相同,分為正常對照組(不照射UVB,加細胞),對照組(照射UVB,加細胞)和空白調零組(不照射UVB,不加細胞)。

        板1處理:細胞培養(yǎng)24h后,吸出培養(yǎng)液,用PBS洗一次,吸出培養(yǎng)液,再加入20 uL的PBS,進行UVB光源照射[UVB照射時間:UVB燈,峰值311 nm,開燈lOmin后用紫外線輻射強度為1.05mW/cm2。輻射劑量控制為30mJ/cm2,輻射時間(S)=輻射劑量(m J/cm2)/輻射強度(m W/cm2) =30sl,其中正常對照組和空白調零不需要輻照(用鋁箔紙遮蓋?。0?處理與板1處理基本一致,UVB光源輻射強度為60s,兩板均換入不同體積分數(shù)(0.5%、1%、3%、5%、10%)的樣品,以35 ppm地塞米松為陽性對照組,以不合加藥樣品的培養(yǎng)液為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h,進行MTT實驗(同嗜熱棲熱菌發(fā)酵液延緩衰老功效研究)。記錄結果,根據(jù)細胞存活率來評價樣品對光損傷的修復能力。

        (4)嗜熱棲熱菌發(fā)酵液劃痕修復功效研究

        通過建立體外細胞創(chuàng)傷模型,加入受試藥物來觀察HSF細胞遷移面積,檢測受試物的劃痕修復能力。收集對數(shù)期細胞,用合10%FBS、1%SK的RPM11640培養(yǎng)液制成HSF細胞懸液,采用血球計數(shù)板計數(shù),用培養(yǎng)液調節(jié)細胞終濃度為2×105個/mL接種于6孔板中,于37℃、5%CO2下培養(yǎng),RPMI 1640全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng),細胞單層融合時,棄去培養(yǎng)液,用無菌200 μL移液器槍頭在細胞層的標記垂直劃痕,6孔細胞培養(yǎng)板板底中央用MARK筆做標記。建立體外細胞創(chuàng)傷模型,PBS反復沖洗,至劃痕區(qū)域干凈。6孔板加入不同體積分數(shù)的不含胎牛血清的培養(yǎng)基及空白組加入不合胎牛血清的培養(yǎng)基,對照組加入含l0%FBS的培養(yǎng)基均2.0mL,設計見表2。觀察0h、24h和48h,定性觀察愈合時間,利用SigmaPlot 14.O軟件計算愈合面積的大小,記錄結果,判斷受試物的愈合能力。

        02 結果與討論

        1.嗜熱棲熱菌發(fā)酵液延緩衰老功效研究

        (1)嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對人永生化表皮細胞(HACAT)毒性的檢測

        如圖1所示,在體積分數(shù)0% - 10%范圍內的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下,HACAT細胞存活率均在100%以上,計算IC50≥10 mg/mL,根據(jù)歐盟國家實驗室化妝品毒性的標準中ICso >1.5 mg/ mL,表明此體積分數(shù)0% -10%范圍內的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液無毒性作用,且具有促進HACAT細胞增殖的能力。

        (2)嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對人皮膚成纖維細胞(HSF)毒性的檢測

        成纖維細胞是皮膚真皮中的主體細胞成分,它不僅能夠合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、基質大分子物質和某些生長因子,同時還具有黏附特性和趨化性,對維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用。隨著年齡的增長,皮膚逐漸老化、皺紋增多、彈性降低,這些表現(xiàn)都與成纖維細胞數(shù)量減少、合成功能下降密切相關[9,10]。

        如圖2所示,在體積分數(shù)0%- 10%范圍內的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下HSF細胞存活率在100%以上,計算IC50≥10 mg/mL,根據(jù)歐盟國家實驗室化妝品毒性的標準中IC50>1.5 mg/ mL,表明此體積分數(shù)O%- 10%范圍內的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液無毒性作用,且具有促進HSF細胞增殖的能力。

        2.嗜熱棲熱菌發(fā)酵液修復功效研究

        (1)嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對人皮膚成纖維細胞(HSF)光損傷修復能力的檢測

        ①由于長期的紫外線輻射會加速皮膚的老化進程,使皮膚提前衰老,所以防曬原料是延緩皮膚衰老產品中必不可少的一類。

        如圖3所示,模擬UVB光源照射HSF細胞30 s建立光損傷修復模型。在體積分數(shù)0.5%- 10%范圍內的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下,除體積分數(shù)為0.5%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下HSF細胞存活率為80.41%,光損傷修復能力相對較低,其他體積分數(shù)的HSF細胞存活率均在130%以上,光損傷修復能力均較強,有促進細胞生長的作用:而陽性對照組地塞米松和正常對照組的HSF細胞存活率為9.73%和19.03%,幾乎沒有光損傷修復能力。表明在體積分數(shù)1% - 10%范圍內嗜熱棲熱菌發(fā)酵液均有較強的光損傷修復能力及延緩細胞衰老的作用。

        ②如圖4所示,模擬UVB光源照射HSF細胞60 s建立光損傷修復模型。在體積分數(shù)0.5%- 10%范圍內的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下,除體積分數(shù)為0.5%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下HSF細胞存活率為63.76%,光損傷修復能力相對較低,其他體積分數(shù)的HSF細胞存活率均在100%以上,光損傷修復能力均較強,有促進細胞生長的作用;而陽性對照組地塞米松和正常對照組的HSF細胞存活率為7.14%和11.97%,幾乎沒有光損傷修復能力。表明在體積分數(shù)1% -10%范圍內嗜熱棲熱菌發(fā)酵液均有較強的光損傷修復能力及延緩細胞衰老的作用。

        (2)嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對人皮膚成纖維細胞(HSF)創(chuàng)傷修復能力的檢測

        如圖5所示,采用槍頭劃痕模擬HSF細胞創(chuàng)傷,根據(jù)HSF細胞遷移面積檢測受試物的劃痕修復能力。在體積分數(shù)1% - 10%范圍內的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下,有不同程度的修復能力,其中體積分數(shù)10%修復能力最強,愈合面積達到21.39%:而對照組愈合面積為43.21%,體積分數(shù)10%嗜熱棲熱菌發(fā)酵液的修復能力達到對照組修復能力的一半,表明體積分數(shù)為10%有較強的創(chuàng)傷修復能力:而體積分數(shù)在1% - 10%范圍內的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液有不同程度的創(chuàng)傷修復能力。

        03 結論

        本研究結果在體外細胞實驗中表明,體積分數(shù)≤10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對人永生化表皮細胞(HACAT)和人皮膚成纖維細胞(HSF)是安全無毒的,且具有促進細胞增殖的作用。

        在光損傷修復模型中,通過不同的光照時間,體積分數(shù)為1% - 10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對人皮膚成纖維細胞(HSF)均有較強的防曬能力及促進細胞生長能力,且具有延緩細胞衰老的功效:在細胞創(chuàng)傷修復模型中,體積分數(shù)在1% - 10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對人皮膚成纖維細胞(HSF)具有不同程度的創(chuàng)傷修復能力。

        嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作為延緩衰老和皮膚損傷修復的個人護理天然原料,應用到延緩皮膚衰老和促進皮膚疤痕修復功效的化妝品之中,應用前景廣闊。

        (作者任職于杭州優(yōu)瑪達生物科技有限公司)

        參考文獻

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