王春利,施文浩,徐 潔

(西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心,西安 710003)

凍融胚胎移植的首例“試管嬰兒”于1984年在澳大利亞的成功出生，是輔助生殖技術(shù)的又一里程碑事件[1]。至今，胚胎冷凍技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用在臨床30多年，它能減少患者促排卵和取卵的次數(shù)，減少胚胎的浪費(fèi)，大大降低患者的痛苦，提高累積妊娠率[2]。同時(shí)，胚胎玻璃化冷凍技術(shù)的應(yīng)用可有效解決胚胎解凍后存活率的情況，避免排卵周期中刺激素對于子宮內(nèi)膜的影響，預(yù)防妊娠過程中可能出現(xiàn)的卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)[1]。因此，全胚冷凍輔助生殖技術(shù)已經(jīng)逐漸作為常規(guī)方案應(yīng)用于臨床[3]。近年來關(guān)于全胚冷凍技術(shù)的臨床研究較多，但關(guān)于取卵數(shù)較多的相關(guān)研究較少，同時(shí)玻璃化冷凍技術(shù)在我國應(yīng)用時(shí)間不長，其安全性尚存在爭議[4]。因此，本研究采取回顧性分析方式，分析首次完整周期且取卵數(shù)大于或等于15個(gè)的患者資料，探究全胚冷凍技術(shù)對首次取卵數(shù)大于或等于15個(gè)患者的累積活產(chǎn)率(cumulative live birth rates，CLBR)和OHSS發(fā)生的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2017年12月在本院行體外受精-胚胎移植且取卵數(shù)大于或等于15個(gè)的2 983例女性患者為研究對象，平均年齡(30.67±3.93)歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次取卵數(shù)大于或等于15個(gè)；(2)存在男方因素、女方排卵因素、女方輸卵管因素、混合因素、不明原因等不孕因素；(3)年齡20～50歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)生殖器畸形；(2)未移植完所有胚胎而終止治療；(3)未移植完所有胚胎而進(jìn)入下一取卵周期；(4)病例和隨訪資料不全。根據(jù)患者接受的胚胎移植方式分為研究組(術(shù)前經(jīng)個(gè)體化評估存在OHSS風(fēng)險(xiǎn)，取卵后行全胚冷凍，擇期復(fù)蘇后移植的患者1 036例)和對照組(取卵后新鮮胚胎周期移植的患者1 947例)。

1.2 方法

1.2.1促排卵方案

所有患者均采用短效長方案，當(dāng)滿足卵泡發(fā)育成熟時(shí)停用卵泡刺激素，抽血檢查患者血清孕酮、黃體生成素和雌二醇水平[5]。當(dāng)晚注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)誘導(dǎo)卵泡成熟，等待36～38 h后行取卵術(shù)。

1.2.2胚胎培養(yǎng)與移植

胚胎放入恒溫培養(yǎng)箱，溫度設(shè)定為37 ℃。培養(yǎng)3 d后，取卵觀察胚胎卵裂期情況，對照組選擇2枚胚胎移植，研究組所有胚胎采用玻璃化冷凍，待患者OHSS風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)化結(jié)合子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備情況，選取移植時(shí)機(jī)。冷凍胚胎移植前要進(jìn)行胚胎復(fù)蘇，成功復(fù)蘇冷凍胚胎的標(biāo)準(zhǔn)為單個(gè)胚胎中至少存在一半以上的卵裂球[6]，見圖1。

A：胚胎卵裂期玻璃化冷凍前；B：胚胎卵裂期玻璃化冷凍后；C：胚囊玻璃化冷凍前；D：胚囊玻璃化冷凍后。

1.2.3子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備

(1)自然周期方案：患者正常排卵且平時(shí)月經(jīng)周期規(guī)律者采用此方案，月經(jīng)來潮后第10天B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)排卵后，及時(shí)檢查患者孕酮水平，冷凍胚胎的移植時(shí)機(jī)根據(jù)孕酮水平?jīng)Q定，每次移植胚胎2枚。當(dāng)孕酮大于或等于1.5 ng/mL時(shí)，于排卵2 d后行卵裂期胚胎移植；當(dāng)孕酮小于1.5 ng/mL時(shí)，于排卵3 d后行卵裂期胚胎移植。(2)人工周期方案：患者自然周期無優(yōu)勢卵泡發(fā)育或平時(shí)月經(jīng)周期不規(guī)律者采用此方案。于月經(jīng)來潮第5天，戊酸雌二醇4 mg/d起始，第8天開始根據(jù)子宮內(nèi)膜生長情況補(bǔ)藥。當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度超過8 mm時(shí)肌內(nèi)注射黃體酮60 mg/d，3 d后移植卵裂期胚胎或者5 d后移植囊胚，每次移植胚胎2枚。

1.2.4黃體支持

所有患者取卵后當(dāng)日開始注射黃體酮針，60 mg/d肌內(nèi)注射，同時(shí)每晚給予地屈孕酮，20 mg/d口服用藥。

1.2.5術(shù)后隨訪調(diào)查

所有患者皆進(jìn)行為期2年的隨訪。行胚胎移植術(shù)14 d后查血HCG，囊胚移植術(shù)后12 d查血HCG，判斷是否妊娠。HCG陽性患者于術(shù)后1個(gè)月行B超檢查，以原始心管搏動(dòng)及宮內(nèi)孕囊的出現(xiàn)作為臨床妊娠的標(biāo)準(zhǔn)。臨床妊娠確定后，行黃體支持至妊娠10周。隨訪終點(diǎn)為患者首次活產(chǎn)或所有胚胎移植完仍無活產(chǎn)。

1.2.6觀察指標(biāo)

本次研究的主要觀察指標(biāo)為OHSS發(fā)生率和CLBR。CLBR為移植完1個(gè)周期所得的胚胎獲得活產(chǎn)的總概率，采用保守CLBR的計(jì)算方法：假設(shè)未成功獲得活產(chǎn)而選擇終止治療的患者，再無活產(chǎn)機(jī)會(huì)。同時(shí)記錄所有患者臨床一般指標(biāo)，包括年齡、身高、體重、不孕因素、基礎(chǔ)卵泡刺激素水平、促性腺激素(gonadotropins，Gn)使用時(shí)間和劑量、獲卵數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者基線資料比較

兩組患者不孕因素和Gn使用時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而年齡、基礎(chǔ)卵泡刺激素水平、BMI、Gn劑量和獲卵數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。考慮到年齡因素對基線資料的影響，對兩組患者采取1∶1傾向性評分匹配，匹配后研究組和對照組患者數(shù)皆為516例，共1 976個(gè)周期。匹配完成后，兩組患者的年齡、不孕因素、基礎(chǔ)卵泡刺激素水平、BMI、Gn使用時(shí)間和劑量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，研究組獲卵數(shù)多于對照組(P<0.05)，見表2。

表1 兩組患者的基線資料比較(傾向性評分匹配前)

組別n基礎(chǔ)卵泡刺激素(x±s,U/L)BMI(x±s,kg/m2)Gn使用時(shí)間(x±s,d)Gn劑量(x±s,U)獲卵數(shù)(x±s,個(gè))研究組1 0365.74±1.1521.04±2.5111.25±2.581 664.76±532.4222.43±4.25對照組1 9476.25±1.5821.66±2.7311.14±2.531 839.46±563.6317.43±2.53t/χ23.974 2.457 1.784 3.091 5.452 P<0.001 0.014 0.075 0.002 <0.001

表2 兩組患者的基線資料比較(傾向性評分匹配后)

組別n基礎(chǔ)卵泡刺激素(x±s,U/L)BMI(x±s,kg/m2)Gn使用時(shí)間(x±s,d)Gn劑量(x±s,U)獲卵數(shù)(x±s,個(gè))研究組5165.83±1.2121.54±2.4111.18±2.261 689.46±542.3921.17±3.34對照組5165.97±1.3821.36±2.5311.21±2.331 749.59±555.7819.58±3.58t/χ21.684 1.004 0.784 1.091 2.382 P0.092 0.315 0.433 0.275 0.017

2.2 兩組患者傾向性評分匹配前后OHSS發(fā)生率比較

傾向性匹配前研究組有2例發(fā)生OHSS，對照組有19例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)；傾向性匹配后研究組無OHSS發(fā)生，對照組有9例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)，見表3。

2.3 兩組患者傾向性評分匹配后不同移植周期CLBR比較

5個(gè)移植周期中，研究組的CLBR均高于對照組，但只在第1個(gè)移植周期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)，見表4。

表3 兩組患者傾向性評分匹配前后OHSS發(fā)生率比較(%)

2.4 兩組患者傾向性評分匹配后不同獲卵數(shù)CLBR比較

不同獲卵數(shù)的研究組CLBR均高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究組的CLBR隨著獲卵數(shù)的增加而增加，對照組在獲卵數(shù)20～24個(gè)時(shí)CLBR最高，見表5。

表4 兩組患者傾向性評分匹配后不同周期CLBR比較(%)

表5 傾向性評分匹配后兩組患者不同獲卵數(shù)CLBR比較(%)

2.5 研究組患者CLBR的多因素logistic回歸分析

多因素logistic回歸分析顯示，獲卵數(shù)和年齡是研究組患者CLBR的重要影響因素。在獲卵數(shù)分組中，20～24個(gè)和25個(gè)及以上的CLBR各是15～19個(gè)的3倍(OR=2.346，95%CI：1.683～3.237)和5倍(OR=5.345,95%CI：4.342～7.182)；在年齡分組中，35～39歲和40～50歲的CLBR各是20～29歲的1/2(OR=0.587,95%CI：0.465～0.718)和1/5(OR=0.247,95%CI：0.175～0.395)。不孕因素、BMI等因素對CLBR無影響(P>0.05)，見表6。

表6 研究組患者CLBR的多因素logistic回歸分析

續(xù)表6 研究組患者CLBR的多因素logistic回歸分析

3 討 論

OSHH或OSHH傾向作為全胚冷凍技術(shù)的重要指征，是進(jìn)行輔助生殖時(shí)常見的并發(fā)癥，病情會(huì)隨著妊娠的進(jìn)展不斷惡化。目前研究表明，HCG是其可能的激發(fā)因素，但具體機(jī)制尚不明確[7]。OSHH具體的臨床表現(xiàn)包括胸腹水、肝腎功能損害、血液濃縮、血栓形成[8]等。已有研究表明，導(dǎo)致OSHH的高危因素主要為卵巢功能較好的年輕女性，在促排卵階段使用較少劑量的促排卵激素便可得到較多的卵泡發(fā)育[9]。

本次研究在初始進(jìn)行基線資料對比時(shí)發(fā)現(xiàn)，研究組的患者年齡明顯低于對照組(P<0.05)，同時(shí)其基礎(chǔ)卵泡刺激素和Gn劑量也明顯低于對照組(P<0.05)，但是獲卵數(shù)卻高于對照組(P<0.05)，與以往研究結(jié)果一致[10]。為了消除年齡對于本研究的影響，筆者采用了1∶1傾向性評分匹配的方法，對兩組患者數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，最終結(jié)果顯示研究組的OHSS發(fā)生率仍明顯低于對照組(P<0.05)，表明全胚冷凍技術(shù)對首次取卵術(shù)大于或等于15個(gè)的患者，可以有效預(yù)防OSHH的發(fā)生，這與MOURAD等[11]薈萃分析的結(jié)果一致。臨床為了提高輔助成功率而增加取卵數(shù)量后，應(yīng)該選用全胚冷凍技術(shù)，從而有效預(yù)防OSHH的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，傾向性評分匹配后研究組的CLBR在5個(gè)移植周期均高于對照組，但是只在第1個(gè)移植周期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本次研究的患者移植周期均不超過5個(gè)，計(jì)算全部患者完整周期后，最終結(jié)果顯示研究組的CLBR高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明對于獲卵數(shù)大于或等于15個(gè)的患者，選擇新鮮胚胎移植和全胚冷凍對于最終的CLBR無影響，這與以往的研究結(jié)果一致[12]。但考慮到首次移植周期內(nèi)的成功率，全胚冷凍技術(shù)要優(yōu)于新鮮周期移植，因此，仍然建議對首次獲卵數(shù)較多的患者優(yōu)先選擇全胚冷凍技術(shù)。

獲卵數(shù)增高、CLBR隨之增加是CLBR的預(yù)測指標(biāo)之一，已經(jīng)得到大家的普遍共識，這也與本研究結(jié)果一致[10]。同時(shí)多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)，獲卵數(shù)增多到一定數(shù)量以后，CLBR并不會(huì)繼續(xù)隨著獲卵數(shù)增多而增加。本研究顯示，對照組在獲卵數(shù)大于或等于25個(gè)時(shí)CLBR并未增加，與以往研究結(jié)果一致[9]。VLAISAVLJEVIC等[13]研究表明，在進(jìn)行新鮮胚胎移植時(shí)，卵巢高反應(yīng)人群的獲卵數(shù)多，因而可以獲得更多的胚胎儲存?zhèn)溆?，但是隨著獲卵數(shù)的增多OSHH的發(fā)生率也隨之升高，這與本研究結(jié)果一致。因此，在實(shí)際臨床選擇取卵數(shù)時(shí)，不可盲目增加，而應(yīng)該根據(jù)患者年齡、不孕原因等因素進(jìn)行分析后選擇。

進(jìn)行全胚冷凍患者CLBR的多因素logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)，不僅獲卵數(shù)是CLBR的強(qiáng)預(yù)測指標(biāo)，年齡也是CLBR的重要預(yù)測指標(biāo)。隨著年齡的增加CLBR會(huì)逐漸下降，年齡分組中，35～39歲和40～50歲CLBR只有20～29歲的1/2和1/5，說明輔助生殖技術(shù)可以讓大多數(shù)不育不孕患者獲得活產(chǎn)，但并不能改變和年齡相關(guān)的妊娠率下降情況。

目前關(guān)于全胚冷凍技術(shù)的應(yīng)用及患者首次取卵數(shù)的選擇尚沒有明確的標(biāo)準(zhǔn)和指南，在實(shí)際的臨床工作中，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)水平和患者的實(shí)際情況進(jìn)行個(gè)體化治療，原則上必須是針對患者全胚冷凍的妊娠結(jié)局優(yōu)于新鮮胚胎移植，或者可以明顯降低患者不良妊娠結(jié)局發(fā)生的可能性[12]。經(jīng)過分析后認(rèn)為，可以作為明確的指征包括：OHSS傾向、卵巢高反應(yīng)、囊胚發(fā)育緩慢、卵泡期激素水平較高。同時(shí)，本研究作為回顧性研究，研究結(jié)果可能存在部分偏倚情況，尚需大樣本的多中心前瞻性臨床研究和薈萃分析進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，全胚冷凍技術(shù)作為一種重要的輔助生殖技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐，但鑒于目前還沒有統(tǒng)一的規(guī)范和指南，要結(jié)合各自生殖中心實(shí)驗(yàn)的技術(shù)水平，對患者的實(shí)際情況進(jìn)行個(gè)體化分析，不可盲目增加取卵數(shù)。對于首次獲卵數(shù)大于或等于15個(gè)的患者，如果有OHSS傾向，優(yōu)先選擇全胚冷凍可以有效降低患者發(fā)生OHSS的可能，同時(shí)有望獲得比新鮮周期患者更高的CLBR。