謝倩倩,田瑞霞,姚榮華,高 靜,吳雋姝,吳明星,趙旭亮△

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第901醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230001； 2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，合肥 230001)

產(chǎn)前超聲檢查可發(fā)現(xiàn)結構異常胎兒，從而分析胎兒是否有先天性遺傳疾病。在經(jīng)超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結構異常后，利用常規(guī)染色體核型分析，可進一步對胎兒染色體結構、數(shù)目異常情況進行分析[1]。但其也有較明顯缺點，如存在培養(yǎng)失敗率、操作要求高、結果易受多種因素影響、耗時長[2]。并且若胎兒染色體組中存在小片段的染色體缺失則可能無法檢出。因此為提高染色體異常檢出的準確性，染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)技術應運而生，其具有能檢出染色體組微小缺失或重復片段的優(yōu)勢，同時能對胎兒全基因組進行掃描，實現(xiàn)對整個染色組的全局分析[3]。但有研究表示，CMA技術對染色體倒位、低水平嵌合體的檢出具有局限性[4]?？紤]可將傳統(tǒng)染色體核型分析技術與CMA技術聯(lián)合應用于結構異常胎兒的染色體分析中，以提高臨床染色體異常檢出率。本研究探討CMA技術與傳統(tǒng)染色體核型分析技術聯(lián)合應用對胎兒結構異常的篩檢效力。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年6月至2019年10月于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第901醫(yī)院進行產(chǎn)前超聲診斷后提示胎兒結構異常、有不良妊娠史或孕前夫妻雙方常規(guī)顯帶核型分析顯示有一方有染色體異常的孕婦131例為研究對象，年齡24～48歲，平均(28.78±2.65)歲，平均孕周(20.25±3.42)周。納入標準：(1)符合中華醫(yī)學會全國超聲醫(yī)學會制訂的產(chǎn)前超聲胎兒結構異常診斷標準[5]，或有流產(chǎn)、畸形兒生育史等不良妊娠史，或夫妻雙方有一方有染色體異常；(2)年齡大于18歲；(3)孕周11～25周。排除標準：(1)家屬或孕婦不同意參與本研究；(2)超聲顯示致死性結構異常；(3)有羊腹腔穿刺禁忌證。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(20180075S03)，孕婦及家屬知情同意。按照檢查方式不同分為CMA組、染色體核型分析組及聯(lián)合組。

1.2 方法

CMA組僅采用CMA技術分析染色體異常，染色體核型分析組僅采用染色體核型技術分析染色體異常，聯(lián)合組采用兩種方式聯(lián)合分析染色體異常。所有孕婦入組后均接受超聲檢查，得到產(chǎn)前診斷指征，然后接受CMA、染色體核型分析檢測。CMA技術具體方法：(1)由同一級別婦產(chǎn)科醫(yī)師采用羊腹腔穿刺技術或臍靜脈穿刺技術，在B超引導下穿刺抽取羊水，為避免孕婦有創(chuàng)穿刺抽取多次羊水，≤24周的孕婦均在首次抽取羊水時共抽取30 mL，10 mL進行CMA檢查，20 mL進行染色體核型分析，>24周的孕婦在首次抽取時共抽取10 mL羊水、1 mL臍血；(2)采用DNA提取劑(北京索萊寶科技有限公司，貨號D1800)提取羊水基因組DNA；(3)參考Infinium公司的Infinium基因芯片檢測標準流程操作，將已處理為短片段的DNA樣本進行擴增，得到擴增片段后對其進行純化，再利用片段化酶將其進行短片段化，并進行生物素標記；(4)將被標記物與雜交液混合變性，加載于750 k芯片上，進行雜交、掃描、分析。參照已存在的數(shù)據(jù)庫進行拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNVs)結果判讀。芯片、雜交試劑盒均購自美國Affymetrix公司。CNVs是指大于1 kb的染色體變異。CMA結果判讀參照DECIPHER、Clinvar、OMIM、DGV、UCSC、ClinGen等數(shù)據(jù)庫標準，將結果判定為3類：致病性CNVs(即確診染色體異常)、良性CNVs及臨床意義不明CNVs[6]。結果判定為致病性CNVs與臨床意義不明CNVs胎兒父母雙方血液進行CMA檢測，用以確切對比CNVs性質及對臨床意義不明CNVs進行明確，避免造成不必要的妊娠終止。

染色體核型分析方法：不同孕周孕婦抽取羊水、臍血方法與上述相同。將抽取的羊水或臍血轉入無菌管中，離心后棄上清液，收集羊水或臍血細胞，于培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10 d后，觀察到細胞貼壁生長良好時將細胞以G帶染色制成染色片，采用高通量全自動染色體核型掃描系統(tǒng)(Gene Company Limited，型號GSL-120)分析染色體核型，每例計數(shù)40個分裂象，若觀察到異常核型則增加到至少50個[7]。分析核型異常種類，包括嵌合體、非整倍體(21三體、18三體、13三體)等。

1.3 觀察指標

觀察不同檢查方式的染色體異常情況，以及不同超聲診斷指征的CMA組和染色體核型分析組染色體異常情況。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同檢查方式的染色體異常情況

單項CMA顯示，22.14%(29/131)致病性CNVs，62.60%(82/131)良性CNVs，15.27%(20/131)臨床意義不明CNVs。單項染色體核型分析顯示，80.15%(105/131)染色體正常，19.85%(26/131)染色體異常，其中19例染色體非整倍體異常(21三體7例，18三體6例，13三體4例，47XXX 2例)、3例嵌合體異常、3例染色體不平衡易位、1例平衡易位。聯(lián)合組檢出的總染色體異常率23.66%(31/131)，其中染色體核型分析結果顯示染色體正常的105例胎兒，有5例由CMA技術檢測出CNVs>326.4 kb，通過與數(shù)據(jù)庫對比，均為致病性CNVs，1p21.3微缺失/微重復綜合征1例，1q44微缺失/微重復綜合征1例，4q25微缺失/微重復綜合征1例，13q12.11微缺失/微重復綜合征1例，16p11.2微缺失/微重復綜合征1例。聯(lián)合組檢出的總染色體異常率最高，但3組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單項CMA檢查與單項染色體核型分析相比，檢測出了除1例平衡易位、1例低水平嵌合體之外的所有染色體異常胎兒，并且檢出了5例單項染色體核型分析顯示染色體正常胎兒的致病性CNVs。

2.2 不同超聲診斷指征的不同檢查方式染色體異常情況

不同超聲診斷指征胎兒CMA與染色體核型分析陽性檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同超聲診斷指征的不同檢查方式染色體異常情況(n)

3 討 論

產(chǎn)前檢查中超聲診斷是發(fā)現(xiàn)胎兒異常、畸形的有效方式[8]。超聲初步發(fā)現(xiàn)胎兒結構異常后，需進行染色體結構數(shù)目異常分析。而染色體核型分析屬傳統(tǒng)的臨床染色體異常分析方法，能根據(jù)染色體長度、著絲點位置等特征，結合顯帶技術，對染色體結構、數(shù)目變異進行直接檢測，識別斷裂、重復、缺失、易位、倒位等異常染色體[9]。但染色體核型分析需對羊水或臍血細胞進行培養(yǎng)后才能進行核型分析，可能存在培養(yǎng)失敗的情況，且細胞培養(yǎng)時間長、耗費人力，不利于提高檢出率[10]。

CMA技術是一種可在全基因組水平上對CNVs片段進行篩查，對微小缺失、重復染色體有明顯檢出優(yōu)勢的染色體異常分析法[6]。它在檢出不同大小的CNVs后，通過與人類已知基因組庫進行對比，可得到致病性CNVs、良性CNVs及意義不明CNVs[11]。并且隨著人類基因組庫的不斷更新，CMA技術能檢出的致病性CNVs越來越多，在產(chǎn)前胎兒結構異常的分析中受到臨床青睞[12]。袁暉等[13]研究顯示CMA技術在胎兒側腦室增寬中的致病性CNVs檢出率高于傳統(tǒng)染色體核型分析。杜柳等[14]研究也顯示CMA技術在頸部透明層增厚胎兒中的致病性CNVs檢出率較高，且在染色體核型分析顯示染色體正常的胎兒中額外檢出了致病性CNVs。雖然CMA技術優(yōu)于傳統(tǒng)染色體核型分析方法，但其仍存在個別異常染色體無法檢出情況。因此將CMA技術與傳統(tǒng)染色體核型分析相結合，可能會提高胎兒染色體異常檢出率。

本研究顯示，聯(lián)合組總檢出31例(23.66%)染色體異常胎兒，其中26例(19.85%)染色體核型分析組也全部檢出，有29例(22.14%)CMA組也全部檢出。這表示無論是何種單項檢測方式，均能檢出大部分染色體異常胎兒，聯(lián)合檢測率更高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，采用CMA技術相對于單項染色體核型分析而言的額外染色體異常檢出率為4.76%，且這部分額外檢出率是在染色體核型分析為染色體正常胎兒中發(fā)現(xiàn)的，并且CMA技術有可檢測染色體異常位點的特點。但CMA技術未能檢出在染色體核型分析中檢出的1例平衡易位、1例低水平嵌合體染色體異常胎兒，這與吳莉等[15]研究顯示的單項CMA無法對平衡易位的染色體進行檢測具有一致性。證實CMA技術雖然能提高染色體異常檢出率，但仍無法完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)染色體核型分析，將兩種檢測方法結合是更有利于全面分析胎兒染色體是否異常的有效方式，既彌補了傳統(tǒng)染色體核型分析無法檢測微小缺失/重復片段的缺點，同時降低CMA技術對平衡易位、低水平嵌合體的漏檢率。

先天性心臟病患兒在胎兒期的超聲檢查中通常都能發(fā)現(xiàn)心血管畸形，發(fā)現(xiàn)異常后及時行產(chǎn)前診斷可以查明病因，為臨床醫(yī)生選擇合適的處理方式提供依據(jù)。本研究中超聲檢出心臟畸形和心內(nèi)膜墊缺失及先天性心臟病和主動脈狹窄的異常。除了心臟畸形，染色體異常胎兒的畸形還常常與神經(jīng)系統(tǒng)畸形、四肢畸關聯(lián)更為緊密，不同類型染色體異常有特定的畸形譜，產(chǎn)前超聲可以了解胎兒形態(tài)及結構異常，比如唐氏綜合征或先天愚型畸形主要表現(xiàn)為NT增厚，腦積水、脈絡叢囊腫，骨骼畸形及消化系統(tǒng)畸形等，部分患兒存在鼻骨缺如等。本次研究中也通過超聲檢測出了腦及神經(jīng)系統(tǒng)畸形，泌尿、消化系統(tǒng)畸形，以及骨骼系統(tǒng)等，且與染色體異常重疊，但是本研究顯示不同超聲診斷指征胎兒CMA與染色體核型分析陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

綜上所述，CMA技術聯(lián)合傳統(tǒng)染色體核型分析的染色體異常檢出率更高，能同時對微小缺失/重復綜合征、平衡易位、低水平嵌合體進行檢測，提高整體染色體異常檢出率，從而為臨床對染色體異常胎兒是否引產(chǎn)提供更有效的參考價值。但本研究納入樣本量有限，未能在不同種類超聲診斷指征中觀察到采用不同檢測方式的明顯差異，后續(xù)可通過對某幾項超聲診斷指征發(fā)生率較高類型進行詳細探究，探究不同檢測方式在不同超聲診斷指征中的應用價值。