梁贛鋒，沈 揚(yáng)，俞遜婕，吳海燕

(浙江省臺州市第一人民醫(yī)院感染科 318020)

手足口病是一種由腸道病毒引起的常見傳染性疾病，輕度患者臨床癥狀以手、足、口腔等部位出現(xiàn)皰疹為主，重癥患者可出現(xiàn)心肌炎、肺水腫、無菌性腦炎等并發(fā)癥甚至出現(xiàn)死亡[1]。重癥病例多由腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)感染引起，病情兇險(xiǎn)，病死率高[2]。因此深入研究EV71感染發(fā)生的機(jī)制對提高臨床療效具有重要的臨床指導(dǎo)意義。去泛素化酶是一類數(shù)量很大的蛋白酶類家族，可通過對底物蛋白的去泛素化來調(diào)控蛋白活性[3]。維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ-1ike receptor，RLR) 為機(jī)體識別病毒的主要免疫識別受體，其介導(dǎo)的信號通路在抵抗病毒感染的過程中發(fā)揮著重要作用[4]。有研究顯示[5]去泛素化酶對EV71感染有一定調(diào)控作用，但其是否通過RLR信號通路發(fā)揮調(diào)控作用尚不清楚。本研究基于RLR信號通路研究去泛素化酶對EV71感染的調(diào)控機(jī)制，以期為臨床防治EV71感染提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞

人橫紋肌肉瘤細(xì)胞A-204購于上海雅吉生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器

10%胎牛血清(上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(上海達(dá)豪生物科技有限公司)；空載質(zhì)粒(上?？吕咨锟萍加邢薰?；去泛素化酶USP4過表達(dá)質(zhì)粒(上海權(quán)陽生物公司)；總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；RIPA裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；Thermo MX150離心機(jī)(蘇州亞凡生物技術(shù)有限公司)；BCA試劑盒(美國Thermo公司)；5%脫脂奶粉封閉液(北京百奧萊博科技有限公司)； 兔抗USP4單克隆抗體(上海晅科生物科技有限公司)，兔抗維甲酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ(RIG-Ⅰ)單克隆抗體(上海信裕生物科技有限公司)，兔抗黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)單克隆抗體(上?？泼羯锟萍加邢薰?，兔抗LGP-2單克隆抗體(武漢維克賽思科技有限公司)，兔抗GAPDH單克隆抗體(上海強(qiáng)耀生物科技有限公司)，山羊抗小鼠IgG(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；ECL發(fā)光試劑盒(上海史瑞克生物科技有限公司)；培養(yǎng)箱(章丘舜澤生物工程有限公司，型號：Thermo BB150)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理

將細(xì)胞分為空白對照組、空載質(zhì)粒組、去泛素化酶組，進(jìn)行原代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(5×106個(gè)/孔)，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%，空白對照組不作任何處理，空載質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染10 nmol/L空載質(zhì)粒48 h后加入EV71(MOI=0.5)，去泛素化酶組轉(zhuǎn)染10 nmol/L去泛素化酶USP4過表達(dá)質(zhì)粒48 h后加入EV71(MOI=0.5)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2RT-PCR檢測各組細(xì)胞EV71 mRNA表達(dá)

采用總RNA提取試劑盒提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：上下游引物各10 μmol/L 0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL，總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性120 s;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循環(huán)。EV71上游引物5′-GAGTGGCAGATGTGATTGA-3′，下游引物5′-TCCAGTGTCTAAGCGATGA-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，測定各擴(kuò)增條帶吸光度值，以目的基因擴(kuò)增條帶吸光度值與GAPDH擴(kuò)增條帶吸光度值之比計(jì)算EV71 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.3Western blot檢測各組細(xì)胞USP4、RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表達(dá)

將細(xì)胞加入RIPA裂解液勻漿裂解，13 000 r/min離心15 min，取上清液。BCA試劑盒測定蛋白濃度并定量，取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉，加入1∶400稀釋的兔抗USP4單克隆抗體、1∶500稀釋的兔抗RIG-Ⅰ單克隆抗體、1∶500稀釋的兔抗MDA5單克隆抗體、1∶500稀釋的兔抗LGP-2單克隆抗體、1∶500稀釋的兔抗GAPDH單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜。加入1∶2 000稀釋的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育60 min，TBST洗膜。ECL發(fā)光試劑盒對PVDF膜進(jìn)行曝光顯影，成像掃描分析系統(tǒng)測定內(nèi)參和目的條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞USP4蛋白表達(dá)

空載質(zhì)粒組細(xì)胞USP4蛋白表達(dá)(0.59±0.13)明顯低于空白對照組(1.23±0.25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；去泛素化酶組細(xì)胞USP4蛋白表達(dá)(2.95±0.88)明顯高于空載質(zhì)粒組和空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞USP4蛋白表達(dá)

2.2 各組細(xì)胞EV71 mRNA表達(dá)

空載質(zhì)粒組和去泛素化酶組細(xì)胞EV71 mRNA表達(dá)(3.77±1.96)、(1.85±1.12)明顯高于空白對照組(0.02±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；去泛素化酶組細(xì)胞EV71 mRNA表達(dá)明顯低于空載質(zhì)粒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表達(dá)

空載質(zhì)粒組細(xì)胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表達(dá)明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；去泛素化酶組細(xì)胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表達(dá)明顯高于空載質(zhì)粒組和空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 各組細(xì)胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表達(dá)比較

圖2 各組細(xì)胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表達(dá)Western blot

3 討 論

EV71是引起手足口病的主要病原體之一，自1974年首次報(bào)道患者體內(nèi)分離EV71后，世界各地相繼報(bào)道EV71感染，近些年我國EV71感染比例逐年上升[6]。目前針對EV71感染臨床無特效藥物，只能對癥治療，盡管近年出現(xiàn)了手足口疫苗，但是引起手足口病毒種類繁多，且病毒變異速度迅速，大大降低了疫苗的預(yù)防作用[7]。因此從EV71感染發(fā)生機(jī)制角度探尋有效治療方案對提高臨床療效有重要意義。

泛素化是常見的蛋白質(zhì)修飾方式之一，蛋白質(zhì)泛素化修飾是可逆的過程，主要通過泛素(ubiquitin，UB)、泛素激活酶E1(ubiquitin activating enzyme E1，UBE1)、泛素結(jié)合酶E2(ubiquitin activating enzyme E2，UBE2)、泛素連接酶E3(ubiquitin activating enzyme E3，UBE3)共同完成[8]?？共《拘盘柾分械牡鞍追肿涌墒艿椒核鼗揎棧绛h(huán)指蛋白135催化RIG-Ⅰ發(fā)生K63連接，從而活化RIG-Ⅰ[9]。去泛素化酶是一類數(shù)量眾多的蛋白水解酶家族，可通過催化去除底物蛋白質(zhì)上的泛素從而逆轉(zhuǎn)泛素化修飾過程[10]。近年來不斷有新的去泛素化酶被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)的去泛素化酶中以泛素特異性蛋白酶USP為主，其相對分子質(zhì)量為105 000～110 000[11]。既往文獻(xiàn)報(bào)道[12]在豬水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)誘導(dǎo)的信號通路中，USP4過表達(dá)能特異性去除RIG-Ⅰ分子K48偶聯(lián)的泛素鏈，抑制VSV復(fù)制增殖。本研究顯示去泛素化酶組A-204細(xì)胞中USP4蛋白表達(dá)明顯高于空載質(zhì)粒組，EV71 mRNA表達(dá)明顯低于空載質(zhì)粒組，提示去泛素化酶USP4具有抗EV71感染作用。RLR是識別胞漿中病毒 RNA的主要受體，其介導(dǎo)的信號通路在抵抗病毒感染的過程中發(fā)揮著重要作用[13]。目前發(fā)現(xiàn)的RLR家族成員包括RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2，其中RIG-Ⅰ、MDA5均包含C端1個(gè)阻遏子結(jié)構(gòu)域 (repressor domain，RD)，以及N端1個(gè)具有三磷酸腺苷(ATP)酶活性的DExD/H-box解旋酶結(jié)構(gòu)域和2個(gè)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteinase，caspase)激活和募集結(jié)構(gòu)域(caspase activation and recruitment domain，CARD)，而LGP-2無CARD[14]。據(jù)報(bào)道[15]RIG-Ⅰ、MDA5識別相應(yīng)病毒RNA結(jié)構(gòu)后，可發(fā)生二聚化，引起下游信號級聯(lián)反應(yīng)。本研究顯示空載質(zhì)粒組細(xì)胞中RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表達(dá)明顯低于空白對照組，提示EV71感染抑制了RLR信號通路。去泛素化酶組細(xì)胞中RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表達(dá)明顯高于空載質(zhì)粒組，提示去泛素化酶USP4可能通過激活RLR信號通路而發(fā)揮抗EV71感染作用，這可為尋找新的藥物作用靶點(diǎn)提供新思路。

綜上所述，去泛素化酶USP4可能通過激活RLR信號通路而發(fā)揮抗EV71感染作用，這可為抗EV71藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用提供新的方向。但去泛素化酶USP4對EV71感染的調(diào)控作用是否還可通過其他機(jī)制有待進(jìn)一步研究。