李 雯,趙 丹，萬(wàn)自芳，張湘燕△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué),貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科/貴州省人民醫(yī)院肺臟免疫性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550002)

慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)是阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)特有的特殊低氧模式[1]。OSAHS是臨床常見(jiàn)的綜合征,目前普遍認(rèn)為其是一種全身性疾病，可致多器官損害,是高血壓的致病因素，也是中風(fēng)、缺血性心肌病、心力衰竭、心律失常、糖尿病等疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。腸道微生物作為人或動(dòng)物的“共生體”，輔助宿主進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)吸收和能量代謝[3]。正常生理狀態(tài)下腸黏膜處于高灌注狀態(tài)，對(duì)缺血、缺氧十分敏感，機(jī)體整體或腸道缺血、缺氧的狀態(tài)會(huì)直接損傷腸黏膜，進(jìn)一步影響腸道微生物的定殖[4]。CIH所致睡眠剝奪可引起多種應(yīng)激反應(yīng)，目前認(rèn)為腸道菌群移位所致的菌血癥和毒素血癥是應(yīng)激反應(yīng)惡性發(fā)展的主要原因，睡眠剝奪可影響大鼠腸道菌群，促進(jìn)有害的產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖[5]。本研究采用高通量測(cè)序研究不同程度CIH條件下大鼠腸道微生物菌群的改變。

1 材料與方法

1.1 建模及分組

選取健康清潔級(jí)雄性Sprague Dawley大鼠30只分為CIH組[A組(O28% 4周)、B組(O28% 8周)]和對(duì)照組，每組10只。CIH組大鼠循環(huán)給予氮?dú)夂脱鯕獬淙肱囵B(yǎng)艙，每次循環(huán)2 min，維持氧濃度在8% 30 s，恢復(fù)氧濃度21% 60 s，每天造模8 h；A組造模4周，B組造模8周。對(duì)照組放置于常氧環(huán)境飼養(yǎng)8周。留取大鼠糞便樣品，用75%乙醇消毒大鼠肛周皮膚，刺激其排便，使用滅菌鑷子從大鼠肛門(mén)部取出糞便保存于無(wú)菌EP管，隨后迅速投入液氮，-80 ℃保存至備用。B組大鼠飼養(yǎng)過(guò)程中死亡2只，對(duì)總體實(shí)驗(yàn)測(cè)序無(wú)影響。

1.2 測(cè)序方法

根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒對(duì)大鼠腸道樣品進(jìn)行DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對(duì)V3、V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min，PCR儀采用ABI GeneAmp?9700型。擴(kuò)增體系：20 μL，4.0 μL 5×FastPfu緩沖液，2.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶，補(bǔ)ddH2O至20 μL；10 ng DNA模板。Illumina MiSeq測(cè)序，2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(美國(guó)Axygen Biosciences公司)進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。QuantiFluorTM-ST (美國(guó)Promega公司)進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE300的文庫(kù)。構(gòu)建文庫(kù)步驟:(1)連接“Y”字形接頭；(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；(4)氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA片段。采用美國(guó)Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息分析

(1)生物信息分析的流程分析使用QIIME2推薦的DADA2方法，其插件對(duì)所有樣品的全部原始序列(input)進(jìn)行質(zhì)量控制(filtered)，去噪(糾正測(cè)序錯(cuò)誤的序列,denoised)，拼接(merged),并且去嵌合體(non-chimeric)，形成OTU。OTU被稱(chēng)為擴(kuò)增特征序列(ASV)，以韋恩圖表示兩組特有或共有的OTU個(gè)數(shù)。將總OTU與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)物種在不同分類(lèi)水平上進(jìn)行注釋?zhuān)詐rofiling 柱狀圖表示兩組物種的相對(duì)豐度。(2)LEfSe方法是非參數(shù)檢驗(yàn)和線性判別分析的結(jié)合，適合菌群豐度差異檢驗(yàn)；LEfSe尋找每一個(gè)分組的特征微生物(LDA大于閾值的微生物,閾值為2，每一橫向柱形體代表一個(gè)物種，柱形體的長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)LDA值，LDA值越高則差異越大。柱形的顏色對(duì)應(yīng)該物種是哪個(gè)分組的特征微生物，特征微生物表示在對(duì)應(yīng)分組中的豐度相對(duì)較高)，也就是相對(duì)于其他分組，在這個(gè)組中豐度較高的微生物組成。(3)α多樣性分析是基于OTU分析結(jié)果，可反映菌群豐度和多樣性，包括chaol、observed-outs、shannon、simpson、ace和faith-pd等指數(shù)來(lái)評(píng)估某個(gè)樣本的物種多樣性，指數(shù)越高，表明樣本的多樣性越復(fù)雜。其中shannon用于估算樣本微生物多樣性，它的計(jì)算考慮到樣品中的分類(lèi)總數(shù)和每個(gè)分類(lèi)所占的比例，在得到整體的Alpha多樣性指數(shù)之后用非參數(shù)Kruskal Wallis檢驗(yàn)方法比較其在各個(gè)樣品分組之間是否有顯著性差異。(4)β多樣性分析是對(duì)不同樣品間的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較。對(duì)每個(gè)樣品的OTU信息構(gòu)建了未加權(quán)的Unifrac距離矩陣(unweightedUnifrac distance matrix)。基于這一矩陣進(jìn)行主成分分析，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離表示樣本菌群差異程度，兩點(diǎn)之間的距離越近，表明兩個(gè)樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度越高，差異越小。在得到整體的Beta多樣性指數(shù)之后，接下來(lái)結(jié)合分組信息運(yùn)用非參數(shù)多元方差分析(PERMANOVA)比較在各個(gè)樣品分組之間的微生物組成結(jié)構(gòu)是否有顯著性差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 OTU和豐度分析

在數(shù)據(jù)按照barcode拆分之后每個(gè)樣品的實(shí)際序列為1 540 848條序列，平均每個(gè)樣品為55 030條。對(duì)照組大鼠OTU為890條，A、B組分別為1 289、1 126條，見(jiàn)圖1。根據(jù)物種注釋結(jié)果，各樣本物種在門(mén)、屬水平分類(lèi)中組成柱狀圖，可見(jiàn)各樣本豐度較高的物種及其比例(圖2、3)。門(mén)水平:CIH組大鼠共有的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)且豐度從高到低依次為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)70%、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)22%、螺旋體門(mén)(Spirochaetes)3%、放線菌門(mén)(Actinobacteria)3%、變形菌門(mén)(Proteobacteria)1.2%、TM7 1.2%，對(duì)照組大鼠共有的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)且豐度從高到低依次為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)73%、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)25%、螺旋體門(mén)(Spirochaetes)0.1%、放線菌門(mén)(Actinobacteria)0.5%、變形菌門(mén)(Proteobacteria)0.6%、TM7 0.2%。屬水平：CIH組大鼠共有的優(yōu)勢(shì)菌群豐度從高到低依次為乳酸菌(Lactobacillus)25%、Unspecified_S24_7 10%、未指明的梭菌目(Unspecified_Clostridiales)10%、未指明的毛螺菌科(Unspecified_Lachnospiraceae)6%、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)5%、未指明的瘤胃球菌科(Unspecified_Ruminococcaceae)4%、未指明的消化鏈球菌科(Unspecified_Peptostreptococcaceae)4%、普雷沃菌屬(Prevotella)4%、普氏菌-1(Prevotella_1)3%、顫螺旋體菌屬(Oscillospira)3%、未指明的梭菌科(Unspecified_Clostridiaceae)3%、密螺旋體屬(Treponema)3%、擬桿菌屬(Bacteroides)2%、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)2%、糞球菌屬(Coprococcus)1%、未指明的F16(Unspecified_F16)1%、蜚蠊目(Blautia)1%、Dorea 1%，對(duì)照組大鼠共有的優(yōu)勢(shì)菌群豐度從高到低依次為乳酸菌(Lactobacillus)46%、Unspecified_S24_7 12%、普雷沃菌屬(Prevotella)8%、未指明的梭菌目(Unspecified_Clostridiales)6%、未指明的毛螺菌科(Unspecified_Lachnospiraceae)4%、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)3%、未指明的瘤胃球菌科(Unspecified_Ruminococcaceae)3%、未指明的消化鏈球菌科(Unspecified_Peptostreptococcaceae)3%、普氏菌-1(Prevotella_1)3%、顫螺旋體菌屬(Oscillospira)2%、未指明的梭菌科(Unspecified_Clostridiaceae)2%、未指明的擬桿菌屬(Unspecified_Bacteroidales)1%。

2.2 OTU差異性分析

門(mén)水平LEfSe差異分析：在CIH組起主要作用的微生物群為螺旋體門(mén)(Spirochaetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)，見(jiàn)圖4。CIH組大鼠腸道菌群豐度較高的有梭菌目、瘤胃球菌科、螺旋體綱、螺旋體門(mén)、螺旋體目、密螺旋體屬、毛螺菌科等；對(duì)照組大鼠腸道菌群豐度較高的有乳酸桿菌科、乳桿菌屬、乳桿菌目、桿菌綱、普雷沃氏菌屬等，兩組屬水平腸道菌群有顯著差異，見(jiàn)圖5。隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)，腸道菌群多樣性越大，見(jiàn)圖6～8。

圖1 各組大鼠OTU韋恩圖

A1～A10:A組；B1～B8：B組；C1～C10：對(duì)照組。

A1～A10:A組；B1～B8：B組；C1～C10：對(duì)照組。

2.3 α多樣性分析

對(duì)照組大鼠shannon指數(shù)與simpson指數(shù)與A組、B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)，差異越大。A組和B組大鼠shannon指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，圖9～11，表1、2。

圖4 門(mén)水平LEfSe分析LDA柱形圖

圖5 CHI組和對(duì)照組屬水平LEfSe分析LDA柱形圖

圖6 A組和對(duì)照組屬水平LEfSe分析LDA柱形圖

圖7 B組和對(duì)照組屬水平 LEfSe分析LDA柱形圖

圖8 A組和B組屬水平 LEfSe分析LDA柱形圖

圖9 A組和對(duì)照組shannon指數(shù)的箱型圖

圖10 A組和B組shannon指數(shù)的箱型圖

圖11 B組和對(duì)照組shannon指數(shù)的箱型圖

表1 各組大鼠腸道微生物群落α多樣性分析

表2 兩組大鼠各指數(shù)比較

2.4 β多樣性分析

對(duì)照組與CIH組主成分分析顯示，前兩個(gè)主成分分別解釋了總變量的32.8%和9.4%，見(jiàn)圖12。在X軸的方向上兩組大鼠腸道菌群相距較遠(yuǎn)，低氧造成菌群差異較大。各個(gè)樣品分組之間微生物菌群有顯著差異，見(jiàn)圖13。

圖12 兩組腸道菌群的主成分分析

A：CIH組對(duì)對(duì)照組箱型圖；B：對(duì)照組對(duì)CIH組箱型圖。

3 討 論

人體消化道中存在豐富的絨毛、微絨毛，微生物可以通過(guò)分泌黏液因子在其中定殖。人體腸道中有約100萬(wàn)億個(gè)細(xì)菌，生理狀況下，各系統(tǒng)、器官的相互協(xié)調(diào)、腸道特有的屏障功能保護(hù)，細(xì)菌和各類(lèi)有毒物質(zhì)不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害。如果這些屏障遭到破壞，微生態(tài)平衡被打破，細(xì)菌和各種毒素可穿過(guò)腸壁，侵入機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)及器官，如淋巴結(jié)、血液、肝、脾等，即腸道菌群移位。人或動(dòng)物的腸黏膜處于高灌注狀態(tài)，因此對(duì)缺血、缺氧十分敏感。機(jī)體整體或腸道缺血、缺氧的狀態(tài)會(huì)直接損傷腸道黏膜系統(tǒng)，導(dǎo)致腸道微生物菌群發(fā)生改變、菌群移位[6-8]。CIH是OSAHS的一種低氧模式，機(jī)體反復(fù)發(fā)生低氧、復(fù)氧過(guò)程中，可能引起類(lèi)似缺血-再灌注的病理生理改變，產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，進(jìn)一步激活炎性反應(yīng)，引起全身性效應(yīng)。筆者通過(guò)腸道菌群高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與CIH組有顯著差異。屬水平CIH組大鼠腸道菌群豐度較高的有梭菌目、瘤胃球菌科、螺旋體綱、螺旋體門(mén)、螺旋體目、密螺旋體屬、毛螺菌科等，對(duì)照組大鼠腸道菌群豐度較高的有乳酸桿菌科、乳桿菌屬、乳桿菌目、桿菌綱、普雷沃氏菌屬、普雷沃氏菌科等。從以上可看出，低氧條件下大鼠腸道菌群發(fā)生改變，有害細(xì)菌增殖，益生菌減少。CIH所致腸道菌群改變類(lèi)似于現(xiàn)代“肺-腸”軸理論的變化，它是肺部與腸道的雙向連接，故肺部發(fā)生疾病時(shí)，腸道微生物也會(huì)產(chǎn)生影響。就如同中醫(yī)有“肺病治腸、腸病治肺、肺腸同治”的觀念。腸道是人體微生物菌群最豐富的地方，雖然下呼吸道細(xì)菌少之又少但其菌群組成上與腸道相似。共同黏膜反應(yīng)觀點(diǎn)指出機(jī)體在一個(gè)黏膜部位接收抗原遞呈細(xì)胞刺激后，細(xì)胞可以遷移至其他黏膜部位，腸道菌群的微生態(tài)可以從局部影響全身的免疫反應(yīng)，從而影響肺黏膜[9]。微生物群與固有免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別受體相互作用，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和固有免疫反應(yīng)。其次腸道菌群代謝產(chǎn)生如乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽等短鏈脂肪酸，其可以通過(guò)激活核因子-κB信號(hào)通路影響免疫細(xì)胞遷移、激活、增殖和凋亡，從而發(fā)揮抗炎作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫功能，預(yù)防過(guò)敏性氣道炎癥的發(fā)生[10-11]。益生菌可以通過(guò)對(duì)免疫細(xì)胞發(fā)揮直接作用，促進(jìn)健康的代謝物的釋放，進(jìn)一步影響微生物群。THORBURN 等[12]實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)高纖維或乙酸鹽喂養(yǎng)小鼠，增加了肺組織中調(diào)節(jié)T細(xì)胞數(shù)量和功能，抑制過(guò)敏性氣道疾病。有實(shí)驗(yàn)研究建立膿毒血癥老鼠模型，在實(shí)驗(yàn)性膿毒癥結(jié)束后，通過(guò)細(xì)菌16S核糖體RNA編碼基因的測(cè)序發(fā)現(xiàn)肺群落以存活的腸道相關(guān)細(xì)菌為主，表明肺微生物群的腸-肺易位和改變可能是膿毒癥和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)發(fā)病的共同機(jī)制[13]。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道將大鼠建立睡眠剝奪模型，分為模型組及對(duì)照組，結(jié)果顯示模型組腸道內(nèi)產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量增加，而其他菌群數(shù)量如大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌則呈現(xiàn)不同程度下降[14]。

有研究推斷毛螺菌在無(wú)菌受者中，毛螺菌株的定植，導(dǎo)致空腹血糖升高、肝臟和腸系膜脂肪組織重量增加、血漿胰島素水平降低等，從而推測(cè)毛螺菌促進(jìn)細(xì)菌脂多糖移位從消化道進(jìn)入血液[15]。有研究發(fā)現(xiàn)睡眠碎片化小鼠引起食物攝入增加和可逆的腸道微生物群變化，其特征是毛螺菌和瘤腎球菌的細(xì)菌成員優(yōu)先生長(zhǎng)，乳酸桿菌科減少，這些導(dǎo)致全身和內(nèi)臟白色脂肪組織炎癥，進(jìn)一步導(dǎo)致腸道上皮屏障破壞[16]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)益生菌如乳酸桿菌能產(chǎn)生β-葡聚糖，使小腸黏膜上皮細(xì)胞表面的黏液更加黏稠，并且更能耐受外界各種有害物質(zhì)及致病菌對(duì)腸道黏膜的損傷[17]。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)OUT豐度分析發(fā)現(xiàn)，屬水平CIH組大鼠乳酸菌(25%)遠(yuǎn)低于對(duì)照組(46%)。

Treg缺失介導(dǎo)的自身免疫性疾病模型小鼠的腸道菌群進(jìn)行基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠模型腸道菌群發(fā)生了嚴(yán)重的紊亂，根據(jù)腸道菌群和代謝組譜的變化，選擇羅伊氏乳酸桿菌和代謝產(chǎn)物肌苷處理Treg缺失小鼠，羅伊氏乳酸桿菌和肌苷通過(guò)激活腺苷受體A2AR抑制了Treg缺失引起的自身免疫性疾病[18]。隨著人們生活質(zhì)量的提高，OSAHS確診率的提高，目前越來(lái)越多的研究證實(shí)OSAHS并不是孤立的疾病，其與機(jī)體代謝、免疫、心血管系統(tǒng)疾病、腸道菌群紊亂密切相關(guān)。因此，更深入認(rèn)識(shí)“肺-腸”軸之間的相關(guān)性，將會(huì)是了解OSAHS整個(gè)過(guò)程中腸道菌群的變化規(guī)律的切入點(diǎn)，深入研究腸道菌群改變對(duì)機(jī)體的影響，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂進(jìn)一步糾正慢性CIH癥狀，有望成為治療OSAHS及各種相關(guān)疾病的靶點(diǎn)。