鄭泰浩，李 明，張曉月，彭 媛，郭政軍，黃 秀，凌豐宇，楊鎮(zhèn)洲△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 402160；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤中心 400010)

肺癌是最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，病死率極高[1]。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC占80%～85%[2-3]，而肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)是NSCLC最常見的亞型，約占40%[4]。 目前，LUAD的診斷和治療等方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，如靶向治療、免疫治療等能明顯改善患者的生存質(zhì)量[5]，但是由于晚期LUAD患者具有高轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)的惡性特征，其5年總體生存率為50%～70%[6]。因此，迫切需要更多的診斷和治療策略來改善LUAD患者的預(yù)后。

隨著高通量測序技術(shù)的進(jìn)步，生物信息學(xué)在腫瘤研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，對尋找更多潛在的腫瘤生物標(biāo)志物有重要意義，進(jìn)而有助于提高預(yù)測LUAD預(yù)后的準(zhǔn)確性，使得疾病的管理更為有效。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)STEAP1高表達(dá)是LUAD預(yù)后不佳的指標(biāo)[7]，血清LINC00173可作為NSCLC患者潛在的輔助診斷生物標(biāo)志物[8]。

FAM72D是一種特異性蛋白編碼基因，屬于FAM72家族基因，該家族由4個基因組成[9]。有研究[10]表明FAM72有潛在的致癌作用，然而目前對FAM72D在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用研究相對較少。既往研究表明，F(xiàn)AM72D是前列腺癌患者的獨立預(yù)后因子；在腎細(xì)胞癌中，F(xiàn)AM72D等7個基因集可以預(yù)測患者預(yù)后[11]；在多發(fā)性骨髓瘤中，F(xiàn)AM72D可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[12]。然而，其在LUAD的作用尚不清楚。本研究通過生存分析、單變量、多變量Cox分析、臨床相關(guān)性等分析了FAM72D在評估LUAD患者預(yù)后中的作用，并進(jìn)行了基因集富集分析、免疫滲透相關(guān)分析，為探討FAM72D在LUAD預(yù)后中的預(yù)測價值和潛在機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載和預(yù)處理

從TCGA下載了535例LUAD組織和59例符合HTSeq-FPKM類型的正常肺組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以及522例LUAD患者的臨床數(shù)據(jù)，在TCGA樣品中，有57例配對LUAD組織和癌旁正常肺組織。通過R軟件(V4.02版本)及Perl軟件(V5.32版本)對上述下載數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，在對LUAD患者的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)分析時，刪除了“未知”“TX”“NX”“MX”和其他樣本。

1.2 基因集富集分析

利用GSEA[13]研究FAM72D在LUAD中的作用機(jī)制。使用GSEA4.1軟件分析來自分子特征數(shù)據(jù)庫(MSigDB)的“c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt”基因組。根據(jù)FAM72D的中位表達(dá)，將總共535例LUAD樣品分為兩組，即FAM72D低表達(dá)組和FAM72D高表達(dá)組。標(biāo)準(zhǔn)化富集得分(NES)絕對值大于或等于1.0，P<0.05和q<0.25被認(rèn)為在某些基因組上差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 免疫浸潤分析

TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是一個綜合性網(wǎng)站，可對32種癌癥類型的免疫浸潤進(jìn)行系統(tǒng)分析[14]。 筆者使用TIMER探索LUAD中FAM72D的表達(dá)與免疫浸潤的相關(guān)性[15]。采用經(jīng)純度校正的partial spearman method (partial-cor)顯示相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Survival和Survminer[16]工具繪制FAM72D和LUAD生存曲線，單因素Cox回歸分析臨床病理特征和FAM72D表達(dá)與總生存的關(guān)系，并進(jìn)行多因素Cox分析。采用Wilcoxon rank sum tests比較LUAD組織和正常肺組織之間FAM72D的表達(dá)，Wilcoxon signed-rank tests比較LUAD組織和臨近配對正常肺組織之間FAM72D的表達(dá)[17]，兩獨立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗、多組獨立樣本Kruskal-Wallis檢驗和Logistic回歸分析臨床病理因素與FAM72D的關(guān)系。箱型圖繪制FAM72D表達(dá)與各種臨床特征之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中FAM72D的生物信息學(xué)分析

TCGA數(shù)據(jù)集的Kaplan-Meier生存分析顯示，F(xiàn)AM72D低表達(dá)與LUAD患者預(yù)后較好相關(guān)，而FAM72D高表達(dá)與預(yù)后較差相關(guān)(P<0.05)，見圖1。單因素Cox分析顯示，F(xiàn)AM72D(HR=1.967，95%CI：1.164～3.324，P=0.012)、臨床分期、T分期、M分期為高危因素，見圖2。多因素Cox分析顯示，F(xiàn)AM72D、臨床分期與總生存率獨立相關(guān)，見圖3。

圖1 FAM72D與LUAD患者的生存分析

圖2 單因素Cox分析

圖3 多因素Cox分析

2.2 FAM72D在LUAD組織和正常肺組織之間表達(dá)差異分析

535例LUAD組織FAM72D表達(dá)較59例正常肺組織明顯上調(diào)(P<0.001)，57例配對的LUAD組織FAM72D表達(dá)較癌旁正常肺組織亦明顯增高(P<0.001)，見圖4、5。

圖4 FAM72D表達(dá)在LUAD組織和正常肺組織的差異

圖5 FAM72D表達(dá)在配對LUAD組織和癌旁正常肺組織的差異

2.3 FAM72D表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性分析

FAM72D的高表達(dá)與高齡(P=0.029)呈負(fù)相關(guān)，與男性(P<0.001)、臨床分期(P=0.003)、T分期(P=0.002)呈正相關(guān)，與M分期(P=0.058)、N分期(P=0.264)無關(guān)，見圖6。

A：年齡；B：性別；C：臨床分期；D：T分期；E：M分期；F：N分期。

2.4 FAM72D參與LUAD的相關(guān)信號通路

細(xì)胞周期、同源重組、剪接體、RNA降解、DNA復(fù)制、P53通路等相關(guān)基因集明顯富集于FAM72D高表達(dá)組，見表1、圖7。

A：細(xì)胞周期通路；B：同源重組通路；C：剪接體通路；D：RNA降解通路；E：DNA復(fù)制通路；F：P53通路。

表1 FAM72D高表達(dá)組基因集富集分析

2.5 FAM72D表達(dá)與LUAD免疫浸潤水平的相關(guān)性分析

FAM72D表達(dá)與LUAD患者B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞滲透水平呈負(fù)相關(guān)，與中性粒細(xì)胞滲透水平呈正相關(guān)(P<0.05),見表2。

表2 FAM72D表達(dá)與LUAD免疫滲透之間的關(guān)聯(lián)

續(xù)表2 FAM72D表達(dá)與LUAD免疫滲透之間的關(guān)聯(lián)

3 討 論

據(jù)報道，中國人群中LUAD是一種發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高、病死率高的惡性腫瘤[18-19]。近年來，LUAD患者人數(shù)不斷增加，原因包括大氣污染、煙草攝入量增加等，大約每年造成180萬人死亡[20]。然而，現(xiàn)階段尚缺乏預(yù)測LUAD預(yù)后的特異性生物標(biāo)志物，因此開發(fā)一種新的有效預(yù)測LUAD預(yù)后的靶點分子至關(guān)重要。

FAM72D在一些癌組織中高表達(dá)，既往研究表明FAM72D可能作為前列腺癌、腎細(xì)胞癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。此外，其表達(dá)與泛素結(jié)合酶E2C(UBE2C)相關(guān)，而UBE2C表達(dá)與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)，因此被認(rèn)為是癌癥治療的一個新靶點[21]。本研究對FAM72D在LUAD中潛在作用進(jìn)行了探索，通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中大量LUAD標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)FAM72D高表達(dá)與LUAD預(yù)后較差相關(guān)，是LUAD患者的獨立預(yù)后指標(biāo)。臨床特征分析顯示，F(xiàn)AM72D表達(dá)與年齡、性別、臨床分期、T分期相關(guān)(P<0.05)，進(jìn)一步分析表明FAM72D在LUAD組織中表達(dá)明顯增高(P<0.05)。既往有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)在TP53突變的癌細(xì)胞中，F(xiàn)AM72基因高表達(dá)，其生長依賴于FAM72D[22-23]，在多發(fā)性骨髓瘤中FAM72D作為FOXM1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分，參與細(xì)胞增殖與存活，是不同癌癥類型的生長所必需的[12]。通過GSEA進(jìn)一步探索了FAM72D在LUAD中潛在的機(jī)制和生物學(xué)功能，結(jié)果表明細(xì)胞周期、同源重組、剪接體、RNA降解、DNA復(fù)制、P53通路等相關(guān)基因集明顯富集于FAM72D高表達(dá)組，這些通路均參與調(diào)控細(xì)胞增殖與存活。此外，越來越多的研究表明腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中各種成分(包括免疫細(xì)胞浸潤)動態(tài)相互作用的結(jié)果[24-25]，WANG等[26]發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞在肺癌的發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，本研究也表明FAM72D表達(dá)水平與B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞滲透水平呈負(fù)相關(guān)，與中性粒細(xì)胞的滲透水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，F(xiàn)AM72D在LUAD中可作為預(yù)后生物標(biāo)志物，并與LUAD中的免疫滲透相關(guān)，研究結(jié)果為LUAD患者的診療及預(yù)后評估提供了一定的理論依據(jù)。然而，本研究尚存在一定局限性：(1)TCGA數(shù)據(jù)庫缺少患者臨床治療策略等信息，如藥物的使用、手術(shù)治療和手術(shù)細(xì)節(jié)，這些因素對于患者的預(yù)后很重要。(2)本研究未深入探索FAM72D參與LUAD發(fā)生發(fā)展、影響免疫微環(huán)境的具體機(jī)制，以及揭示影響免疫治療療效的關(guān)系，這些需進(jìn)一步通過基礎(chǔ)實驗加以證實。