趙 強(qiáng)，潘焯儀，吳欣新，張妙蓮，冼詩瑤，吳海濤

甲型血友病是一種常見的X染色體連鎖隱性遺傳病[1]，在新出生男嬰中的發(fā)生率約為1/5 000[2]，其臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度具有較大差異性，主要是由血漿中凝血因子Ⅷ的功能活性所決定[3]。凝血因子Ⅷ是一種血漿糖蛋白，相對分子質(zhì)量為267 kD，是凝血級聯(lián)反應(yīng)中一種重要輔助因子[4]。F8基因是凝血因子Ⅷ的編碼基因，共包含26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子[5]。F8基因突變可造成凝血因子Ⅷ的數(shù)量或活性降低，從而影響凝血的級聯(lián)反應(yīng)，造成凝血功能障礙。目前，甲型血友病仍無有效的根治方案，只能通過定期補(bǔ)充凝血因子Ⅷ緩解病情的發(fā)展[6]，通過孕前、胚胎前及產(chǎn)前診斷進(jìn)行干預(yù)，預(yù)防患兒出生，可大大降低家庭及社會(huì)壓力。因此，鑒定先證者致病基因突變就成為最關(guān)鍵的一步。

F8基因突變種類多樣，已報(bào)道的突變包括錯(cuò)義突變、小插入缺失、倒位及拷貝數(shù)突變[7]，還有部分患者無法找到致病基因突變，僅存在mRNA表達(dá)水平下降[8-9]。查詢Human Gene Mutation Database(HGMD)可知，截至2019年1月，已報(bào)道的F8基因致病基因突變有3 000種以上，隨著致病基因突變數(shù)據(jù)庫的不斷擴(kuò)大，新突變報(bào)道的頻率越來越低。本研究通過對一個(gè)甲型血友病家系進(jìn)行F8基因突變的篩查，檢測到一個(gè)未報(bào)道過的致病基因突變，并分析相關(guān)分子機(jī)制，確定其為該家系致病基因突變，并對2名該家系女性突變攜帶者進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

1 對象與方法

1.1對象 患者，女，29歲，孕14+3周，2017年 7月22日于筆者醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前遺傳咨詢。孕婦的2個(gè)舅舅曾確診為甲型血友病，有明確出血病史，實(shí)驗(yàn)室檢測活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)延長，免疫檢查為陰性。凝血因子活性檢測，因子Ⅸ(factor Ⅸ，F(xiàn)Ⅸ)活性正常，因子Ⅷ(factor Ⅷ，F(xiàn)Ⅷ)活性明顯降低，但家系所有成員并未進(jìn)行基因診斷，家系成員關(guān)系見圖1。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審核批準(zhǔn)，患者知情同意。

圖1 甲型血友病家系圖

1.2方法

1.2.1凝血功能檢測 對該家系中所有成員采集外周血，進(jìn)行凝血功能檢測，檢測指標(biāo)包括凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、凝血酶原時(shí)間國際標(biāo)比率(international normalized ratio，INR)、APTT、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)、凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)、FⅧ活性、血漿D-二聚體(D-dimer，D-Di)。

1.2.2DNA提取及基因檢測 對家系成員抽取外周血，采用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit, 德國Qiagen公司)提取基因組DNA，對F8基因外顯子及剪接位點(diǎn)區(qū)域使用特異性引物擴(kuò)增，再行Sanger測序，測序數(shù)據(jù)通過與人類基因組參考序列(hg19)進(jìn)行比對，鑒定出F8基因外顯子區(qū)域及剪接位點(diǎn)的非同義突變及3個(gè)堿基內(nèi)的插入缺失突變；采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)(SALSA P178 F8 probemix, 荷蘭MRC-Holland公司)對F8基因區(qū)域進(jìn)行檢測，檢測有無50個(gè)以上堿基拷貝數(shù)的突變；使用重型血友病AF8基因22號內(nèi)含子倒位基因檢測試劑盒(深圳亞能生物技術(shù)有限公司)采用LD-PCR法[10-11]檢測F8基因的22號內(nèi)含子倒位。

1.2.3基因測序數(shù)據(jù)分析 首先檢測出患者的所有基因變異，在HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、1000 Genomes、Hapmap(http://www.internationalgenome.org)、Pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)及萬方(http://www.wanfangdata.com.cn/index.html)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，判斷該突變是否已報(bào)道，并在家系其他成員中驗(yàn)證該突變，判斷基因突變與家系成員臨床表型是否存在共分離。然后，在50例無血緣關(guān)系且凝血功能正常的個(gè)體中檢測該基因突變，確定其在本地人群的發(fā)生頻率。最后對該基因突變位點(diǎn)進(jìn)行生物功能學(xué)分析，通過Sift(http://provean.jcvi.org/index.php)和Ployphen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml)軟件預(yù)測突變功能，并通過SWISS-MODEL Homology Modelling對突變后蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測及新發(fā)突變位置的氨基酸在不同物種的保守性分析，分析該突變對蛋白質(zhì)功能的影響。

1.2.4產(chǎn)前診斷 家系中2例男性胎兒Ⅳ1及Ⅳ2 分別在孕16周和17周行羊膜腔穿刺術(shù)取羊水20 mL，采用微量樣品基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，按說明書提取DNA。進(jìn)而對2例胎兒的羊水DNA及其父母外周血DNA檢測c.529T>C突變，判斷胎兒是否攜帶致病性突變，并對父母、胎兒進(jìn)行STR位點(diǎn)檢測分析，確定羊水DNA有無母血污染及標(biāo)本混淆的狀況。

1.2.5新生兒凝血功能檢測 胎兒出生后半年左右，進(jìn)行血常規(guī)及相關(guān)凝血功能檢測，并定期隨訪。

2 結(jié) 果

2.1家系成員凝血功能檢測 家系成員凝血功能檢測發(fā)現(xiàn)，Ⅱ1和Ⅱ4凝血功能顯著異常，其中凝血因子Ⅷ活力降低，分別為4.7%和5.2%，其余成員凝血功能均正常(表1)。

表1 家系成員的凝血功能檢查

2.2對先證者進(jìn)行F8基因檢測 對Ⅱ1(男性患者)的F8基因外顯子區(qū)域及剪接位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測序，檢測出F8基因c.529T>C(p.Tyr177His)純合突變(圖2)，考慮到該突變位于X染色體，男性僅有1條X染色體，所以應(yīng)為該突變的半合子。MLPA結(jié)果顯示，F(xiàn)8基因區(qū)域無插入缺失突變，也未檢出22號內(nèi)含子倒位。

A：野生型位點(diǎn)測序圖，家系成員Ⅳ1；B：純合突變測序圖，家系成員Ⅱ1；C：雜合突變測序圖，家系成員Ⅲ2。

2.3文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫檢索 通過檢索HGMD、1000 Genomes、Hapmap、Pubmed及萬方等數(shù)據(jù)庫，均未發(fā)現(xiàn)有報(bào)道該突變，證實(shí)該突變?yōu)樾挛稽c(diǎn)。

2.4家系基因與臨床表型共分離分析 對家系中其他成員(Ⅰ2，Ⅱ2，Ⅱ4，Ⅱ6，Ⅲ2，Ⅲ3)通過Sanger測序?qū).529T>C位點(diǎn)進(jìn)行檢測，2個(gè)男性患者(Ⅱ1和Ⅱ4)為c.529T>C半合子突變；Ⅰ2，Ⅱ2，Ⅲ2及Ⅲ3為c.529T>C突變雜合子攜帶者。該位點(diǎn)在該家系中符合基因突變與臨床表型共分離。此外，在50例無血緣關(guān)系且凝血功能正常的女性個(gè)體中未檢出該突變，確定其為罕見突變。

2.5生物信息學(xué)分析 通過Sift軟件預(yù)測為“有害性突變”(得分值<10-3，閾值為0.05)，Provean軟件預(yù)測也是“有害性突變”(得分值-4.7，閾值為-2.5)，Ployphen軟件預(yù)測為“很可能致病性突變”，通過SWISS-MODEL Homology Modelling軟件進(jìn)行了突變蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖3)，發(fā)現(xiàn)該突變造成F8蛋白177位由酪氨酸變?yōu)榻M氨酸，由疏水性中性氨基酸變?yōu)橛H水性堿性氨基酸，理化性質(zhì)均發(fā)生了顯著改變。同時(shí)，通過多物種序列比對(圖4)，F(xiàn)8蛋白177位氨基酸處于非常保守的狀態(tài)。綜合上述依據(jù)，判斷該突變?yōu)榭赡苤虏⌒酝蛔儭?/p>

A：野生型F8蛋白結(jié)構(gòu)；B：F8蛋白p.Tyr177His突變?nèi)S結(jié)構(gòu)。紅色圓圈內(nèi)為177位氨基酸。

紅色框內(nèi)為177位氨基酸。

2.6產(chǎn)前診斷結(jié)果 家系成員Ⅲ2強(qiáng)烈要求進(jìn)行產(chǎn)前診斷，通過與孕婦充分溝通，并簽署知情同意書后，于孕17周抽羊水，通過Sanger測序，結(jié)果顯示未攜帶有c.529T>C突變(圖2A)。通過對父母胎兒DNA進(jìn)行STR位點(diǎn)檢測分析，確定羊水DNA無母血污染及標(biāo)本混淆狀況，并符合遺傳規(guī)律，未發(fā)現(xiàn)羊水有母血污染干擾。胎兒Ⅳ1出生后7個(gè)月采靜脈血，血常規(guī)及凝血功能檢測結(jié)果均正常(表1)。

2018年3月，家系成員Ⅲ3也于孕16周要求行產(chǎn)前診斷，排查胎兒是否攜帶c.529T>C突變，結(jié)果顯示也未攜帶該突變，胎兒Ⅳ2出生5個(gè)月采靜脈血，血常規(guī)及凝血功能檢測結(jié)果也正常(表1)。

3 討 論

甲型血友病是一種常見的X染色體連鎖隱性遺傳病，是由F8基因缺陷導(dǎo)致凝血因子Ⅷ缺乏或功能缺陷所引起[12]。本家系Ⅲ2于孕14+3周時(shí)首次就診，自訴具有甲型血友病家族史，主動(dòng)尋求產(chǎn)前診斷，但該家族各成員均未進(jìn)行過相關(guān)基因檢測。本研究對該家系先癥者Ⅱ1進(jìn)行了F8基因常見遺傳突變系統(tǒng)性篩查，檢出一個(gè)新突變c.529T>C(p.Tyr177His)。為判斷該突變的致病性，進(jìn)一步檢測該家系中各個(gè)成員該突變位點(diǎn)基因型，確定了c.529T>C在該家系中與個(gè)體的臨床表型完全共分離，符合X染色體連鎖隱性遺傳規(guī)律。

本研究使用基因突變功能預(yù)測軟件Sift和Polyphen對突變c.529T>C(p.Tyr177His)進(jìn)行致病性分析，均提示該突變?yōu)橛泻π酝蛔僛13-14]。通過SWISS-MODEL Homology Modelling軟件進(jìn)行突變蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測和F8蛋白多物種保守性分析，均表明該177位氨基酸具有重要功能性。再檢索人類致病性突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)及已發(fā)表的中英文文獻(xiàn)，均無該突變報(bào)道，確定其為新突變。有1例相似病例報(bào)道了c.530A>G(p.Tyr177Cys)突變，也導(dǎo)致F8蛋白的177位氨基酸改變，導(dǎo)致輕型甲型血友病[15]，表明第177位氨基酸對維持蛋白功能活性具有重要影響。但此例c.530A>G(p.Tyr177Cys)突變是由酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔野彼岷桶腚装彼峋鶠橹行园被?，兩者等電點(diǎn)分別為5.66和5.02。而本研究中檢出的c.529T>C(p.Tyr177His)突變是由酪氨酸變?yōu)榻M氨酸，組氨酸屬于堿性氨基酸，等電點(diǎn)為7.59。理論上可以推測該突變造成的理化性質(zhì)變化比已報(bào)道的c.530A>G位點(diǎn)更加顯著，造成的蛋白質(zhì)功能改變同樣也更顯著。而實(shí)際上本研究中2個(gè)男性患者為c.529T>C(p.Tyr177His)半合子，凝血因子Ⅷ活力分別為4.7%和5.2%，臨床表現(xiàn)符合中度血友病特征[16]。

本研究在該血友病家系中系統(tǒng)地對F8基因常見致病性突變進(jìn)行檢測，并通過可疑致病位點(diǎn)家系共分離檢測和相應(yīng)生物信息學(xué)方法分析預(yù)測，鑒定出F8基因c.529T>C(p.Tyr177His)為該甲型血友病家系疑似致病性基因突變。該新突變造成該家系2例男性患者表現(xiàn)為中度血友病特征，且為本研究首次報(bào)道。本研究對該家系中2個(gè)突變攜帶孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，排除了2個(gè)男胎攜帶該致病性突變，2個(gè)男嬰出生半年左右，凝血功能檢測均正常，進(jìn)一步證明了c.529T>C確實(shí)為該家系致病突變，本研究為F8基因致病突變譜貢獻(xiàn)了一新突變，并明確了其致病性、患者凝血功能及臨床表現(xiàn)。