趙 偉，陳雅琪，魏 霞，駱 凱,3，羅 嵐,3

近年來(lái)，隨著物質(zhì)生活水平的提高，人們對(duì)于飲料的需求量日益增多。研究顯示，市售的多種飲料均可造成牙釉質(zhì)不同程度脫礦，從而導(dǎo)致牙酸蝕癥和齲壞[1-2]。本研究選用4種常見(jiàn)的市售普通飲料處理恒牙牙釉質(zhì)，并測(cè)定牙釉質(zhì)的鈣、磷溶出情況以及牙釉質(zhì)表面顯微硬度(surface microhardness，SMH)，比較4種飲料對(duì)恒牙牙釉質(zhì)的酸蝕及脫礦作用的影響。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑 慢速鋸(IsoMet Low Speed Saw，美國(guó)Buehler公司)；臺(tái)式pH酸度計(jì)(pH211型，意大利HANNA公司)；iMarkTM酶標(biāo)儀(680型，美國(guó)Bio-Rad公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-5200，上海元析儀器有限公司)；甲基丙烯酸樹(shù)脂(II型，上海新世紀(jì)齒科材料有限公司)；數(shù)字顯微硬度計(jì)(HXD-1000TM/LCD，上海光學(xué)儀器廠)。實(shí)驗(yàn)飲料(飲料A：碳酸飲料；飲料B：果醋類飲料；飲料C：茶飲料；飲料D：運(yùn)動(dòng)飲料)。人工唾液配方參照ISO/TR10271：1993標(biāo)準(zhǔn)，主要成分如下：0.400 g的NaCl，0.400 g的KCl，0.795 g的CaCl2·2H2O，0.780 g的NaH2PO4·2H2O，0.005 g的 Na2S·2H2O，1.000 g尿素以及1 000 mL去離子水。

1.2方法

1.2.1恒牙的收集和保存 選取筆者醫(yī)院門診收治的因正畸治療需要而拔除的恒牙25顆。患者年齡18～25歲，無(wú)長(zhǎng)期碳酸飲料暴露史、釉質(zhì)發(fā)育良好、無(wú)脫鈣、無(wú)磨耗。牙齒排除標(biāo)準(zhǔn)：齲壞、根裂、牙合面有充填修復(fù)體、做過(guò)根管治療；肉眼觀牙冠顏色及形態(tài)與正常有差異，或有其他缺陷。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，患者均簽署知情同意書(shū)。

25顆恒牙拔除前均去除色素和菌斑，拔除后去凈牙髓組織，截除牙根后使用慢速鋸將牙冠縱向劈開(kāi)，共計(jì)50個(gè)樣本，置于新鮮配置的人工唾液中，于4 ℃冰箱保存，拔牙后2周內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.24種飲料的pH值及鈣、磷、糖濃度檢測(cè) 4種飲料各取1 mL，使用pH計(jì)檢測(cè)pH值；采用Bio-Rad IMARK酶標(biāo)儀，應(yīng)用鄰甲酚肽絡(luò)合銅法檢測(cè)飲料的鈣濃度、磷鉬酸法檢測(cè)飲料的磷濃度、葡萄糖氧化鎂法檢測(cè)飲料的糖含量，茶多酚含量見(jiàn)飲料成分表。

1.2.34種飲料浸泡后恒牙鈣、磷離子釋放程度檢測(cè) 將50個(gè)樣本浸泡于人工唾液中，于37 ℃恒溫水浴箱中預(yù)處理24 h，之后分5組(n=10)，分別浸泡于4種飲料及人工唾液中(對(duì)照組)。采用間斷性浸泡，每次浸泡1 min，取出30 s，再次浸泡，完成5次浸泡后取出，蒸餾水清洗5遍，放回37 ℃人工唾液水浴恒溫箱浸泡24 h，第2天重復(fù)以上操作，每天每組試件重復(fù)上述飲料浸泡5次，每天浸泡均更換新鮮的飲料，連續(xù)處理7 d。每次浸泡所用的飲料均收集于無(wú)菌試管中，混勻后用于測(cè)定飲料及人工唾液中鈣、磷含量的變化，連續(xù)測(cè)量7 d。

1.2.44種飲料浸泡后牙釉質(zhì)SMH的測(cè)量 分別在實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)的第1～7天采用數(shù)字顯微硬度計(jì)檢測(cè)5組樣本的SMH。使用500 g負(fù)荷維氏鋼錐連續(xù)打擊釉質(zhì)開(kāi)窗區(qū)表面20 s，使其形成壓痕，測(cè)量壓痕的兩對(duì)角線長(zhǎng)度，輸入計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算出SMH。所有樣本均在開(kāi)窗部位的不同點(diǎn)反復(fù)測(cè)量多次。每個(gè)樣本的開(kāi)窗區(qū)均測(cè)量5個(gè)點(diǎn)，取測(cè)量壓痕規(guī)則的3個(gè)點(diǎn)的平均值作為該樣本該次的SMH值(單位為HV)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)不同種類飲料處理后的牙釉質(zhì)SMH以及鈣、磷溶出值采用重復(fù)測(cè)量方差分析的統(tǒng)計(jì)方法，兩兩比較采用Bonferroni法校正顯著水平，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.14種飲料的pH值及鈣、磷、糖濃度 4種飲料及人工唾液的pH值分別為2.93，3.75，6.48,3.79和6.73，所含的鈣、磷、糖檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，其中茶飲料的茶多酚含量為998 mg/L，余未測(cè)出茶多酚。

表1 4種飲料的pH值和鈣、磷、糖濃度等的檢測(cè)結(jié)果

2.24種飲料浸泡后牙釉質(zhì)鈣、磷溶出量 4種飲料浸泡后，恒牙牙釉質(zhì)鈣、磷的溶出量見(jiàn)表2和圖1。4種飲料均能導(dǎo)致恒牙牙釉質(zhì)出現(xiàn)不同程度的脫礦，其中果醋類飲料和運(yùn)動(dòng)飲料對(duì)牙釉質(zhì)中鈣、磷的溶出作用最明顯，而茶飲料的溶出作用最不明顯。在不同飲料中持續(xù)試驗(yàn)7 d后，浸泡液中鈣、磷濃度的變化差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。飲料種類和作用天數(shù)兩種因素共同作用導(dǎo)致的鈣、磷濃度變化的差別也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4種飲料導(dǎo)致鈣、磷的溶出量與人工唾液對(duì)照組比較，變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且同種飲料各時(shí)間點(diǎn)的鈣、磷濃度變化差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 4種飲料導(dǎo)致恒牙牙釉質(zhì)鈣、磷溶出量的變化

2.3不同類型飲料浸泡后牙釉質(zhì)SMH變化 經(jīng)碳酸飲料、果醋類飲料以及運(yùn)動(dòng)飲料連續(xù)浸泡7 d后，恒牙牙釉質(zhì)的SMH均顯著下降，而茶飲料組的SMH值起初呈平穩(wěn)下降趨勢(shì)，之后逐步回升。不同飲料按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)浸泡7 d，各組牙釉質(zhì)SMH值間的差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，飲料種類和實(shí)驗(yàn)天數(shù)兩種因素共同作用對(duì)恒牙牙釉質(zhì)SMH的降低也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3，圖1C)。4種飲料處理過(guò)的牙釉質(zhì)SMH均較人工唾液對(duì)照組均有所下降，其中碳酸飲料組、果醋類飲料組、運(yùn)動(dòng)飲料組與對(duì)照組的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且浸泡的1～7 d與實(shí)驗(yàn)前比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 4種飲料導(dǎo)致恒牙牙釉質(zhì)表面顯微硬度的變化

n=10。1組：人工唾液；2組：碳酸飲料；3組：果醋類飲料；4組：茶飲料；5組：運(yùn)動(dòng)飲料。A：鈣溶出量；B：磷溶出量；C：牙釉質(zhì)表面顯微硬度。

3 討 論

在過(guò)去的幾十年里，軟飲料的消費(fèi)量急劇增加，其中兒童和青少年對(duì)軟飲料的消費(fèi)增幅最大。過(guò)量飲用含高糖和高酸的軟飲料，都會(huì)對(duì)牙齒和身體造成不利影響，包括齲齒、超重、肥胖和增加患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。目前一些市售的飲料為了加強(qiáng)口感，常添加一些高酸度的成分，可導(dǎo)致釉質(zhì)的脫礦。Milosevic等[4]認(rèn)為，牙齒的酸蝕與飲用飲料有關(guān)，頻繁飲用或睡前飲用果汁、碳酸飲料均會(huì)增加牙齒酸蝕的嚴(yán)重程度。為了評(píng)估不同種類飲料對(duì)恒牙牙釉質(zhì)脫礦的影響，本實(shí)驗(yàn)選用因正畸治療需要而拔除的新鮮恒牙，以常見(jiàn)的市售飲料進(jìn)行浸泡，檢測(cè)浸泡前后飲料中鈣、磷含量以及牙釉質(zhì)SMH的變化。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外均有學(xué)者開(kāi)展飲料對(duì)牙釉質(zhì)脫礦作用相關(guān)影響的研究[5-6]。然而，這些研究多將牙齒或牙片長(zhǎng)時(shí)間浸泡于同一飲料中，與日常生活情況不符。Maupomé-Carvantes等[7]研究表明，定量研究飲料的實(shí)際作用時(shí)，實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)盡量接近現(xiàn)實(shí)生活，得出的結(jié)果才真實(shí)可信。Xavier等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，酸性碳酸飲料對(duì)牙釉質(zhì)表面的酸蝕作用在接觸5 min內(nèi)即可發(fā)生。故本研究采用間斷性浸泡的方式，每次浸泡均使用新鮮溶液持續(xù)1 min，間歇30 s，共進(jìn)行5次。實(shí)驗(yàn)間隙期各組樣本均浸泡于人工唾液中，使實(shí)驗(yàn)條件盡量接近日常飲用飲料的實(shí)際狀態(tài)。

牙釉質(zhì)是人體內(nèi)組織中最硬且鈣化程度最高的組織。牙釉質(zhì)的硬度由其所含無(wú)機(jī)物的晶體決定，釉質(zhì)中不穩(wěn)定型的磷酸鈣鹽，在酸性環(huán)境下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致鈣、磷離子釋出[9]。Featherstone等[10]利用定量顯微放射照相技術(shù)測(cè)定牙釉質(zhì)礦物質(zhì)的含量，發(fā)現(xiàn)其與顯微硬度儀測(cè)得的硬度值具有顯著的相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：4種不同種類的飲料均可對(duì)牙釉質(zhì)造成不同程度的脫礦作用，導(dǎo)致釉質(zhì)中鈣和磷溶出并降低SMH，且不同飲料間的作用差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中果醋類飲料組的鈣、磷溶出作用最明顯，而茶飲料組的溶出作用不明顯。對(duì)4種飲料的pH值檢測(cè)結(jié)果顯示，果醋類飲料、碳酸飲料、運(yùn)動(dòng)飲料的pH值均較低，屬于酸性飲料，低于牙釉質(zhì)脫礦的臨界值(5.0～5.5)[11]，因此上述飲料均可使恒牙牙釉質(zhì)中不穩(wěn)定的磷酸鈣鹽發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而溶出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了果醋類飲料、碳酸飲料和運(yùn)動(dòng)飲料中的鈣、磷溶出量較高。結(jié)果也顯示碳酸飲料浸泡組牙釉質(zhì)的鈣、磷溶出量并不是最多，究其原因可能是由于可樂(lè)等碳酸飲料鈣、磷含量較高，因此浸泡液中的鈣、磷較快達(dá)到飽和狀態(tài)，使其溶出量并不是最多。唾液中高濃度鈣、磷離子過(guò)飽和時(shí)容易形成結(jié)晶，結(jié)晶沉積在牙釉質(zhì)脫礦面上，促進(jìn)了釉質(zhì)再礦化。Attin等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在碳酸飲料中添加鈣、磷酸鹽和氟化物可降低碳酸飲料的腐蝕潛力，鈣和磷酸鹽的添加顯示出有益的效果，但并不能完全防止釉質(zhì)溶解。而向碳酸飲料中添加甘油磷酸鈣能顯著防止釉質(zhì)SMH的降低和礦物質(zhì)的損失[13]。

Maupomé等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，脫礦1周后牙表面的壓痕即不容易看清，不能準(zhǔn)確反映牙釉質(zhì)礦物質(zhì)的含量和脫礦程度，因此本研究選擇將恒牙牙釉質(zhì)塊浸泡于飲料7 d內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)分析，結(jié)果顯示，從浸泡前到實(shí)驗(yàn)后第7天，碳酸飲料、果醋類飲料以及運(yùn)動(dòng)飲料導(dǎo)致的恒牙牙釉質(zhì)SMH均值均明顯降低。Li等[15]通過(guò)原子力顯微鏡，在納米水平上定量評(píng)估了可口可樂(lè)等市售飲料在不同時(shí)間點(diǎn)所引起的人類牙釉質(zhì)表面粗糙度(RQ)和彈性模量(E)的變化，結(jié)果顯示，在接觸可樂(lè)等碳酸飲料的過(guò)程中，牙齒的表面逐漸變得粗糙，而且隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，牙釉質(zhì)的彈性模量E值下降幅度變大，本研究結(jié)果與之一致。而茶飲料浸泡組則在實(shí)驗(yàn)前期呈平穩(wěn)下降趨勢(shì)，之后呈現(xiàn)回升的趨勢(shì)。究其原因可能因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)測(cè)得的茶飲料的pH為6.48，Gul等[16]發(fā)現(xiàn)紅茶浸泡處理的牙菌斑酸堿度均高于牙脫礦臨界值(pH=5.5)，對(duì)牙齒的脫礦作用影響較小。茶飲料與其他飲料相比較，富含茶多酚、氟化物和鐵，茶多酚能抑制致齲菌的生長(zhǎng)，氟離子能進(jìn)入羥磷灰石晶體中，形成氟化鈣，增加釉質(zhì)抵抗飲料的酸蝕，降低釉質(zhì)溶解度減少脫礦。Soares等[17]發(fā)現(xiàn)，在未經(jīng)氟化物保護(hù)的牙釉質(zhì)中，牙釉質(zhì)表面經(jīng)過(guò)各種軟飲料浸泡腐蝕后可檢測(cè)到不同程度的凹陷、疏松、表面不規(guī)則和結(jié)構(gòu)破壞，而經(jīng)過(guò)氟處理保護(hù)的牙釉質(zhì)，避免了軟飲料酸蝕后釉質(zhì)表面粗糙度的增加。

綜上所述，果醋類飲料、運(yùn)動(dòng)飲料以及碳酸飲料均可導(dǎo)致牙釉質(zhì)出現(xiàn)不同程度的脫礦，其中果醋類飲料的脫礦作用最強(qiáng)，其次是運(yùn)動(dòng)飲料及碳酸飲料，而茶飲料對(duì)牙釉質(zhì)的脫礦作用相對(duì)較輕。建議兒童及青少年應(yīng)盡量減少酸性飲料的攝入頻率。人體口腔是個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，牙釉質(zhì)的酸蝕受到多方面影響：菌斑生物膜，唾液的流動(dòng)，機(jī)械沖洗速度，飲料在口腔內(nèi)接觸的頻率和方式，不同溫度飲料酸蝕作用等，因此影響口腔內(nèi)牙齒酸蝕化學(xué)反應(yīng)的因素有許多，今后還需進(jìn)一步進(jìn)行相應(yīng)的研究。