傅芬蕊，張 婭，潘玉紅，曹穎平，鄭培烝

不動桿菌屬細菌是一群革蘭陰性、氧化酶陰性、不發(fā)酵糖類的球桿菌，屬于條件致病菌，其中鮑曼不動桿菌、Pittii不動桿菌、Nosocomialis不動桿菌和醋酸鈣不動桿菌由于遺傳背景相似，通過傳統(tǒng)的細菌鑒定系統(tǒng)很難在表型上區(qū)分開來，故統(tǒng)稱為醋酸鈣-鮑曼不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus-Acinetobacterbaumannii，Acb)復(fù)合體。Acb復(fù)合體是引起院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染常見病原體之一，常導(dǎo)致患者泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、創(chuàng)面?zhèn)诟腥炯熬Y[1]。

由于抗菌藥物的廣泛使用，目前不動桿菌屬細菌幾乎對現(xiàn)有所有種類的抗菌藥物的敏感性呈現(xiàn)逐年下降趨勢。而碳青霉烯類抗菌藥物作為新一代β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，是目前臨床上控制革蘭陰性菌感染最有效的藥物之一，對不動桿菌屬細菌具有良好的抗菌作用，是治療不動桿菌屬細菌重癥感染的首選抗菌藥物。但自1991年美國報道首例碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌(Carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)以來，世界各地耐碳青霉烯類不動桿菌的報道屢見不鮮。不動桿菌主要通過產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜孔蛋白的表達缺失或下調(diào)、藥物的主動外排泵系統(tǒng)活性增強、青霉素結(jié)合蛋白位點改變及整合子等遺傳元件快速傳播耐藥基因等的作用導(dǎo)致對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥[2]。本研究對筆者醫(yī)院分離的10株非重復(fù)的對亞胺培南耐藥的產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1, NDM-1)Acb復(fù)合體的耐藥機制進行研究，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集筆者醫(yī)院血液科、呼吸內(nèi)科和ICU等科室分離的10株非重復(fù)的對亞胺培南耐藥的產(chǎn)NDM-1的Acb復(fù)合體。

1.2儀器與試劑 全自動微生物分析儀(VITEK-2 compact)、革蘭陰性細菌GN鑒定卡、AST-GN16藥敏卡片、亞胺培南Etest試紙條、MBL(IP/IPI)Etest試紙條及不動桿菌屬REP-PCR分型試劑盒(法國生物梅里埃公司)；PCR擴增儀(2720，美國Applied Biosystems公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ，美國BIO-RAD公司)；超純微生物DNA提取試劑盒(美國MOBIO司)；Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)及dNTP(2.5 mmol/L)(北京天根生化科技有限公司)；M-H瓊脂(英國Oxoid公司)；生物分析儀(2100)及DiversiLab芯片(美國Agilent公司)；微量紫外可見分光光度計(ND-1000，美國NanoDrop公司)。引物的合成及PCR產(chǎn)物測序由上海博尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定與藥敏試驗 經(jīng)全自動微生物分析儀進行鑒定和藥敏試驗，10株Acb復(fù)合體均對亞胺培南耐藥。采用亞胺培南Etest試紙條對亞胺培南耐藥性進行驗證，藥敏結(jié)果根據(jù)2019年CLSI的抗菌藥物敏感性試驗標準進行判斷，以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株，實驗過程嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行[3]。通過42 ℃生長實驗及PCR法檢測OXA-51-like基因與rpoB基因序列分析鑒定具體菌種。PCR的擴增體系為25 μL：上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，1 μL模板DNA，2.5 μL 10×Taq Buffer，2 μL dNTP，0.5 μL Taq 聚合酶(2.5 U/μL)，用滅菌水補至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行結(jié)果分析。電泳陽性產(chǎn)物送公司測序，所得測序結(jié)果通過BLAST與GenBank中的序列進行比對，rpoB基因匹配度≥98%且最高者可認定為該菌種。引物名稱、引物序列及預(yù)計產(chǎn)物長度見表1。

1.3.2金屬酶表型篩選試驗 采用MBL(IP/IPI)Etest法，實驗過程嚴格按照產(chǎn)品說明書進行。以大腸埃希菌ATCC 25922作為陰性質(zhì)控菌株，以本實驗室保存的金屬酶陽性的大腸埃希菌作為陽性質(zhì)控菌株。結(jié)果參照說明書進行判定：以單藥與復(fù)合制劑的MIC比值≥8，即IP/IPI≥8，或IP/IPI之間出現(xiàn)幻影圈，或IP與IPI中一項出現(xiàn)畸變?nèi)?，判定為金屬酶表型篩選試驗陽性。

1.3.3碳青霉烯酶基因檢測及測序 PCR法擴增常見的A類碳青霉烯酶基因(KPC，GES，SME，IMI/NMC)，B類金屬酶基因(NDM-like，IMP-like，VIM-like，SIM-1，GIM-1和SPM)和D類苯唑西林酶基因(OXA-23-like，OXA-24-like，OXA-58-like和OXA-143-like)。NDM-like陽性的菌種擴增NDM基因全長。PCR的擴增體系及條件同上。電泳陽性產(chǎn)物送公司測序，所得測序結(jié)果通過BLAST與GenBank中的序列進行比對。引物名稱、引物序列及預(yù)計產(chǎn)物長度見表1。

1.3.4外膜孔蛋白及外排泵基因檢測與測序 利用PCR法檢測外膜孔蛋白carO和oprD基因，以及外排泵相關(guān)基因(包括adeB，adeI，adeJ，adeK基因和adeS調(diào)節(jié)基因)。PCR擴增體系和條件同上。陽性產(chǎn)物送公司測序，測序結(jié)果與GeneBank中的序列進行比對。引物名稱、引物序列及預(yù)計產(chǎn)物長度見表1。

表1 擴增耐藥基因相關(guān)引物信息

1.3.5REP-PCR基因分型 依照超純微生物DNA提取試劑盒操作說明書提取10株Acb復(fù)合體基因組DNA，分光光度計測DNA濃度，調(diào)整濃度為25～50 ng/μL。根據(jù)不動桿菌屬REP-PCR分型試劑盒的要求，應(yīng)用REP-PCR引物進行擴增，配制25 μL PCR反應(yīng)體系：2 μL Primer Mix A，2 μL基因組DNA，18 μL PCR MM1，2.5 μL 10×Taq緩沖液，0.5 μL Taq聚合酶(2.5 U/μL)。反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s→50 ℃ 30 s→70 ℃ 90 s，循環(huán)35次；70 ℃延伸3 min。將擴增產(chǎn)物、凝膠、DNA Marker和Ladder按照說明書順序注入DiversiLab DNA芯片相應(yīng)孔中。將上述芯片放入漩渦振蕩適配器中，2 200 r/min離心1 min。芯片在5 min內(nèi)放入生物分析儀進行分析。采用生物分析儀檢測結(jié)果，并使用DiversiLab分型系統(tǒng)配套軟件分析，得到各菌株相應(yīng)的樹狀圖與虛擬電泳圖。根據(jù)虛擬電泳圖中條帶的位置和數(shù)目等特征及樹狀圖相似性判斷菌株的同源性。同源性判斷標準：無差別，樹狀圖相似性>97.5%，且虛擬電泳圖沒有條帶差異；相似，樹狀圖相似性>95%，虛擬電泳圖上有1～2個不同的條帶或條帶的位置不同；不同，樹狀圖相似性<95%，虛擬電泳圖上有≥3個不同的條帶或條帶的位置不同。

2 結(jié) 果

2.1菌株鑒定與表型篩查結(jié)果 本次共收集到10株耐碳青霉烯類抗菌藥物的Acb復(fù)合體，其中Pittii不動桿菌5株，Nosocomialis不動桿菌3株，鮑曼不動桿菌2株。經(jīng)亞胺培南Etest試紙條驗證，結(jié)果均對亞胺培南耐藥。金屬酶表型檢測試驗結(jié)果均為陽性(表2)。B類碳青霉烯酶基因、外膜孔蛋白基因和外排泵基因中所列基因為檢測陽性的基因。

表2 10株醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復(fù)合體金屬酶表型檢測與碳青霉烯類耐藥相關(guān)基因檢測結(jié)果

2.2碳青霉烯酶基因檢測與測序結(jié)果 10株不動桿菌NDM-full型基因均為陽性，電泳結(jié)果與預(yù)計條帶大小相近，如圖1所示，將PCR產(chǎn)物進行雙向測序，并與GenBank中的序列進行比對，證實10株不動桿菌與NDM-1基因序列一致。2株鮑曼不動桿菌OXA-51-like基因均陽性，其中1株OXA-23-like基因陽性；其他檢測的碳青霉烯酶基因陰性。5株P(guān)ittii不動桿菌中，2株OXA-58-like基因陽性，其他檢測的碳青霉烯酶基因陰性。3株Nosocomialis不動桿菌 中，除NDM-1外，其他檢測的碳青霉烯酶基因陰性(表2)。將以上陽性擴增產(chǎn)物送由公司進行雙向測序，并與GenBank中的序列進行比對，結(jié)果符合。

M為100 bp DNA Ladder；N為陰性對照；C14和C50號為鮑曼不動桿菌；A605,606,609,625和640為Pittii不動桿菌；A607,611和615為Nosocomialis不動桿菌。

2.3外膜孔蛋白及外排泵基因檢測與測序結(jié)果 在外膜孔蛋白基因檢測方面，2株鮑曼不動桿菌carO基因均為陽性，oprD基因1株陰性1株陽性；5株P(guān)ittii不動桿菌中，carO基因均為陰性，oprD基因均為陽性；3株Nosocomialis不動桿菌中，carO和oprD基因均為陽性。在外排泵基因檢測方面，2株鮑曼不動桿菌中，adeB，adeI，adeJ及adeK基因均為陽性；5株P(guān)ittii不動桿菌中，adeI及adeK基因均為陽性，4株adeJ基因陽性，1株adeB基因陽性；3株Nosocomialis不動桿菌中，adeB,adeI,adeJ及adeK基因均為陽性。以上菌株均未檢測到adeS基因(表2)。

2.4基因分型結(jié)果與同源性分析 5株P(guān)ittii不動桿菌分為A和B兩型，其中A型2株，1株來自血液科二區(qū)，1株來自呼吸內(nèi)科；B型3株，分別來自血液科二區(qū)、綜合ICU和心外科ICU(圖2)。3株Nosocomialis不動桿菌分為A和B兩型，其中A型2株，B型1株，均來自血液科二區(qū)(圖3)。2株鮑曼不動桿菌型別不同(結(jié)果未顯示)，分別來自神經(jīng)內(nèi)科和綜合ICU。每組的A與B型之間同源性都較差，圖譜上均有超過3個條帶的位置不同。

圖2 5株P(guān)ittii不動桿菌的分型結(jié)果

圖3 3株Nosocomialis不動桿菌的分型結(jié)果

3 討 論

在探討不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥機制的研究中，報道較多且最為主要的是產(chǎn)碳青霉烯酶，多見B類金屬酶和D類苯唑西林酶(oxacilllinase，OXA)，A類酶少見，其中金屬酶水解活性最強。目前在不動桿菌中發(fā)現(xiàn)的金屬酶有IMP,VIM,SIM和NDM等，其中NDM-1型酶已有較多報道。苯唑西林酶目前已發(fā)現(xiàn)200多種型別，按組別可以分為OXA-23,OXA-24,OXA-51,OXA-58和OXA-143組等。在不動桿菌中僅檢出NDM-1基因或OXA基因(特別是OXA-23基因)的報道較多，但二者同時檢出的相關(guān)報道較少，而在Pittii不動桿菌同時檢出NDM-1基因和OXA-58-like基因的報道更少，目前僅在馬來西亞和我國的廣東省有檢出[13-14]。此次在福建省Pittii不動桿菌中同時檢出NDM-1和OXA-58-like基因、在鮑曼不動桿菌中同時檢出NDM-1和OXA-23-like基因應(yīng)引起院感部門足夠的重視。

目前對于外膜孔蛋白與外排泵在不動桿菌耐藥中所起作用的研究相對較少。與不動桿菌耐碳青霉烯類抗菌藥物有關(guān)的的外膜孔蛋白主要有CarO蛋白和OprD蛋白。外膜孔蛋白缺失或表達量不足，外膜通透性降低，導(dǎo)致抗菌藥物無法進入細菌體內(nèi)或進入減少，藥物達不到有效濃度，從而產(chǎn)生耐藥。OprD蛋白缺失引起菌株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，在銅綠假單胞菌中較為常見，在不動桿菌中研究較少。外排泵系統(tǒng)(包括AdeABC，AdeFGH和AdeIJK等)也是引起鮑曼不動桿菌多重耐藥的重要因素之一[15]。而目前發(fā)現(xiàn)與耐碳青霉烯類抗菌藥物有關(guān)的外排泵主要是耐藥結(jié)節(jié)細胞分化超家族的AdeABC和AdeIJK。AdeABC的結(jié)構(gòu)基因片段主要為adeB，其表達受上游的adeRS雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)。自然狀態(tài)下adeB基因不表達或者表達量極低，只有通過adeRS調(diào)控系統(tǒng)使該基因過度表達才能發(fā)揮外排泵的主動外排作用。本次實驗結(jié)果顯示，10株不動桿菌的adeRS調(diào)控系統(tǒng)的adeS調(diào)節(jié)基因均為陰性，因此可認為10株不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥可能與AdeABC外排泵無關(guān)。AdeIJK的結(jié)構(gòu)基因片段主要為adeI,adeJ和adeK，目前在它們附近并未找到調(diào)控系統(tǒng)，因此其表達可能并不受特定基因調(diào)節(jié)。5株P(guān)ittii不動桿菌的carO基因均為陰性，oprD基因與AdeIJK外排泵基因大多為陽性，推測在5株P(guān)ittii不動桿菌中CarO缺失，AdeIJK外排泵的表達是導(dǎo)致對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的原因之一。而3株Nosocomialis不動桿菌和1株鮑曼不動桿菌外膜孔蛋白基因及AdeIJK外排泵基因均陽性，推測以上細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥可能是AdeIJK外排泵和NDM-1共同作用的結(jié)果。

目前，用于不動桿菌的分型方法較多，脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)是公認的微生物分子分型方法的金標準，但其操作相對復(fù)雜且所需時間長，不大適用于實時評估疫情。本研究采用的是基于REP-PCR的DiversiLab分型系統(tǒng)，具有操作簡單、重復(fù)性好、分型結(jié)果與PFGE有較好一致性，且能快速檢測和實時檢測等優(yōu)點，是較為理想的細菌分型方法。本研究對10株不動桿菌進行分型，2株攜帶NDM-1型基因的鮑曼不動桿菌之間同源性差，與國內(nèi)外學(xué)者報道的常見的CRAB分型結(jié)果及攜帶NDM-1型基因鮑曼不動桿菌的分型結(jié)果不同[16]，提示此2株攜帶NDM-1的鮑曼不動桿菌與其他地區(qū)CRAB流行的型別不同，可能是散發(fā)感染，但由于分析的菌株數(shù)量過少，具體機制有待進一步研究。5株P(guān)ittii不動桿菌分為兩型(A和B型)，經(jīng)查相關(guān)臨床資料，其中3例B型患者在住院時間上有交叉，存在病區(qū)間相互交叉感染的可能。3株Nosocomialis不動桿菌雖然均來自血液科，但分為兩型，其中2例A型(菌株編號為A607和615)患者都是血液科長期住院患者，且共同住院時間達6個月以上，提示存在病區(qū)內(nèi)的交叉感染。另一例血液科患者感染的Nosocomialis不動桿菌為B型，提示同一病區(qū)內(nèi)可能存在不同的感染源，此結(jié)果也說明DiversiLab分型系統(tǒng)是一個有效的分型系統(tǒng)，可以很容易判斷菌種的同源性?？梢娫卺t(yī)院內(nèi)甚至在福建省內(nèi)建立不動桿菌監(jiān)測平臺，創(chuàng)建相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，掌握不動桿菌的流行趨勢，可為預(yù)防耐碳青酶烯類不動桿菌的流行并及早采取有效措施提供堅實的基礎(chǔ)。基于福建省內(nèi)出現(xiàn)同時攜帶NDM-1基因和OXA基因的不動桿菌，應(yīng)規(guī)范各種醫(yī)療操作以及對醫(yī)療器械的消毒，同時應(yīng)合理使用抗菌藥物并加強院內(nèi)感染的宣傳和教育工作，努力健全和完善醫(yī)院感染監(jiān)控與管理體系。

本研究的不足之處在于不動桿菌NDM-1陽性率較低，收集的菌種偏少，筆者將在以后的研究中擴大樣本量，以期進一步全面了解福建省攜帶NDM-1不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制。