（江蘇省淮安環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 淮安 223001）

0 引言

隨著人類社會(huì)經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，越來越多的廢水排入水體，水中N，P 含量急劇增加，為藻類提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成藻類大量增殖，水體富營(yíng)養(yǎng)化和藍(lán)藻水華現(xiàn)象在世界各地頻繁爆發(fā)[1]。飲用水水源地受到污染威脅，水體中的藍(lán)藻及藍(lán)藻毒素直接危及飲用水安全，藻華及毒素的監(jiān)控技術(shù)成為當(dāng)今科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。傳統(tǒng)的藍(lán)藻水華監(jiān)測(cè)方法主要通過顯微鏡鏡檢法對(duì)水體中的藻細(xì)胞計(jì)數(shù)并分類，后來又通過藻類的16S rDNA 序列分析進(jìn)行藻種分類，然而這些方法不能區(qū)分產(chǎn)毒微囊藻和非產(chǎn)毒微囊藻，因此不能在藍(lán)藻暴發(fā)之前進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)[2-3]?，F(xiàn)采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）的方法對(duì)淮安地區(qū)5 個(gè)飲用水源地的水體藍(lán)藻基因及毒素進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，探索qPCR 用于水源地預(yù)警監(jiān)測(cè)的可行性。

1 藍(lán)藻毒素的種類及危害

藍(lán)藻毒素是水華藍(lán)藻細(xì)胞破裂后釋放出來的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，在淡水中的種類很多。根據(jù)毒素對(duì)生物的毒性作用及毒素的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，藍(lán)藻毒素主要分為作用于肝臟的肝毒素和作用于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒素2 種類型，其它還有細(xì)胞毒性、皮膚毒性和刺激毒性藻毒素，如脂多糖、皮膚毒素等，主要包括微囊藻毒素(microcystin)、節(jié)球藻毒素(nodularin)和柱孢藻毒素(cylindrospermopsin)等[4-5]。但是并非所有的藍(lán)藻都會(huì)產(chǎn)生藻毒素，因?yàn)樵孱愂欠衲軌虍a(chǎn)生藻毒素，取決于細(xì)胞中是否含有產(chǎn)毒基因。產(chǎn)毒藻基因組中含有相關(guān)藻毒素合成酶基因，可對(duì)毒素合成進(jìn)行調(diào)控；非產(chǎn)毒藻中不含產(chǎn)毒基因，兩者在遺傳特征上存在明顯差異。藍(lán)藻產(chǎn)生的毒素見表1[6]。

表1 藍(lán)藻毒素及主要產(chǎn)毒藻類

2 研究方法

2.1 方法原理

分子生物學(xué)技術(shù)中的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）是利用高度專一性引物及探針結(jié)合到目的基因片段上，通過復(fù)制擴(kuò)增該目的基因片段，使該技術(shù)的檢出限非常低（達(dá)到25 copies/mL），通過不同波段的檢測(cè)器檢測(cè)熒光，根據(jù)基因的熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)的擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)來定量目的基因。qPCR 中目的基因片段經(jīng)過引物及探針2 次高辨識(shí)度的篩選，基本上不會(huì)錯(cuò)誤識(shí)別基因片段，數(shù)據(jù)的錯(cuò)誤率極低。實(shí)驗(yàn)通過qPCR 技術(shù)檢測(cè)水體中2 項(xiàng)藍(lán)藻基因（總微囊藻基因、總柱孢藻基因）、3 項(xiàng)產(chǎn)毒基因（產(chǎn)毒微囊藻基因、產(chǎn)柱孢藻毒基因、產(chǎn)蛤蚌毒素基因）與2 項(xiàng)產(chǎn)臭基因（產(chǎn)2-MIB 基因、產(chǎn)土味素基因）的濃度含量，再結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)分析3種藍(lán)藻毒素（微囊藻毒、柱孢藻毒及蛤蚌毒素），用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定2 種臭味素（2-MIB 和土味素）的含量，并對(duì)其結(jié)果一致性進(jìn)行比較。

2.2 點(diǎn)位設(shè)置

在淮安市區(qū)的4 個(gè)飲用水源地和1 個(gè)白馬湖備用水源地各設(shè)置1 個(gè)點(diǎn)位，分別為城南取水口、市取水口、淮陰區(qū)取水口、開發(fā)區(qū)取水口和白馬湖備用水源地取水口。

2.3 樣品采集與采樣時(shí)間

2019年12月中旬按地表水采樣規(guī)范要求[7]在5個(gè)點(diǎn)位各采集1 L 水樣，在備用水源地加采1 個(gè)平行樣，低溫冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。

2.4 儀器和方法

分析方法：藍(lán)藻基因和產(chǎn)毒產(chǎn)臭基因采用qPCRTaqMan 法，分析儀器為CFX Connect 熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)(BioRad)；藻毒素采用酶聯(lián)免疫吸附ELISA 法，分析儀器為酶聯(lián)儀Multiskan FC Microplate Photometer；2 種臭味素采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)SPME-GCMS 法，分析儀器為氣相層析儀GC/MS6890A(Agilent)。

3 結(jié)果與分析

3.1 藍(lán)藻基因及毒素結(jié)果分析

5 個(gè)水源地的藍(lán)藻基因及毒素的分析結(jié)果詳見表2。由表2中可知：

（1）飲用水源地已受藍(lán)藻水華影響，其中普遍存在產(chǎn)柱孢藻毒基因(基因濃度為6.5×103～2.5×104copies/mL)及毒素(毒素值在0.07～0.17 μg/L)，表明已經(jīng)存在具有產(chǎn)柱孢藻毒能力的藍(lán)藻且已產(chǎn)生柱孢藻毒。雖然柱孢藻毒并未超過世界衛(wèi)生組織(WHO)的建議值（1 μg/L），但采樣點(diǎn)已暴露于柱孢藻毒的風(fēng)險(xiǎn)中，需持續(xù)關(guān)注產(chǎn)柱孢藻毒基因的消長(zhǎng)。

（2）除了開發(fā)區(qū)取水口外，其它測(cè)點(diǎn)均檢出總微囊藻基因，且市取水口、城南取水口及白馬湖平行樣皆檢出產(chǎn)毒微囊藻基因。由于樣品中并未檢出微囊藻毒，推測(cè)藍(lán)藻產(chǎn)毒基因并未表現(xiàn)進(jìn)而產(chǎn)生微囊藻毒。需持續(xù)關(guān)注微囊藻的生長(zhǎng)狀態(tài)，避免微囊藻毒的暴露風(fēng)險(xiǎn)。

（3）所有采樣點(diǎn)產(chǎn)蛤蚌毒素基因及蛤蚌毒素均為未檢出，說明暫無蛤蚌毒素的危害風(fēng)險(xiǎn)。

表2 藍(lán)藻基因及毒素分析結(jié)果

3.2 藍(lán)藻基因及臭味檢測(cè)結(jié)果分析

5 個(gè)水源地的藍(lán)藻基因及嗅位物質(zhì)的檢測(cè)分析結(jié)果見表3。分析表3可知，除了備用水源外所有采樣點(diǎn)均無土味素和2-MIB 的風(fēng)險(xiǎn)存在。白馬湖備用水源檢出微量產(chǎn)2-MIB 基因，且同時(shí)檢出微量2-MIB，表明備用水源已存在具有產(chǎn)2-MIB 能力的藍(lán)藻。該結(jié)果與化學(xué)分析方法檢測(cè)結(jié)果基本相同，體現(xiàn)了分子生物學(xué)方法和化學(xué)分析方法檢測(cè)結(jié)果的高度一致性。

表3 藍(lán)藻基因及臭味分析結(jié)果

4 結(jié)論

（1）本次共調(diào)查4 個(gè)飲用水源地和1 個(gè)備用水源地，有3 個(gè)采樣點(diǎn)檢出柱孢藻毒，說明飲用水源存在柱孢藻毒的污染風(fēng)險(xiǎn)，須密切注意具產(chǎn)柱孢藻毒能力的藍(lán)藻生長(zhǎng)狀況；4 個(gè)采樣點(diǎn)檢出總微囊藻基因但整體基因濃度較低，且未檢出微囊藻毒，表明目前水源地暫無微囊藻毒的風(fēng)險(xiǎn)，但仍需持續(xù)關(guān)注微囊藻的基因濃度是否增加而誘發(fā)微囊藻毒的生成；所有采樣點(diǎn)的產(chǎn)蛤蚌毒素基因及蛤蚌毒素均未檢出，表明不存在蛤蚌毒素的危害風(fēng)險(xiǎn)。

（2）所有飲用水源地均未檢出產(chǎn)2-MIB 基因和產(chǎn)土味素基因，說明不存在藍(lán)藻臭味物質(zhì)的污染風(fēng)險(xiǎn)；白馬湖備用水源檢出微量產(chǎn)2-MIB 基因和2-MIB，說明該采樣點(diǎn)已存在產(chǎn)2-MIB 能力的藍(lán)藻，具有一定的藍(lán)藻臭味物質(zhì)污染風(fēng)險(xiǎn)，需持續(xù)關(guān)注。

（3）藍(lán)藻水華及其毒素污染已成為飲用水安全的主要危害之一，由此帶來的水生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[8]。該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了分子生物學(xué)方法和化學(xué)分析方法對(duì)水源地藍(lán)藻基因及藻毒素監(jiān)測(cè)結(jié)果的高度一致，認(rèn)為該技術(shù)可作為鑒定產(chǎn)毒藍(lán)藻和非產(chǎn)毒藍(lán)藻更加有效的手段，能在藻毒素暴發(fā)前做出預(yù)警，在飲用水源預(yù)警監(jiān)測(cè)和保護(hù)中具有廣闊的應(yīng)用前景[9]。