郭雨楠，霍艷穎，吳實權(quán)，梁冰冰，張云茜，趙一帆， 周常喜，安 蕊，馬洪海，姜代勛*，霍桂桃

(1.北京農(nóng)學院 動物科學技術(shù)學院/獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京102206； 2.中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心，北京100176)

貝那普利(Benazepril)是第三代血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，通過阻遏血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換為血管緊張素Ⅱ，起到擴張血管、降低血壓、減輕心臟負荷等作用，廣泛用于人的高血壓和心功能不全等的治療[1,2]。隨著人們生活水平的提高及寵物診療行業(yè)的發(fā)展，犬貓等寵物壽命普遍延長，心臟病等老齡化疾病逐年增多。由于寵物專用心臟病藥品的缺乏，歐洲在2012年批準了貝那普利用于寵物臨床，國內(nèi)近年也有相應(yīng)的貝那普利產(chǎn)品上市，用于犬心力衰竭及犬貓慢性腎病等的治療。研究表明，貝那普利對犬慢性心力衰竭、擴張性心肌病等有明顯效果[3-5]。心力衰竭犬臨床常常出現(xiàn)心肌收縮力減弱，心臟排血量減少，靜脈回流受阻，動脈供血不足，全身血液循環(huán)障礙及體溫降低等癥狀[6]。依據(jù)心陽虛證的診斷標準：心功能減退和虛寒證[7]，可知臨床上多數(shù)心力衰竭犬具有心陽虛證的特點。就此以阿霉素聯(lián)合冰水浴冷刺激法制備心陽虛大鼠模型，探明貝那普利對其臨床癥狀和心功能相關(guān)指標心電圖ST段、心率、心肌酶以及心肌組織病理學的影響，為其在臨床上對寵物心陽虛證的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SPF級雌性Sprague Dawley(SD)大鼠40只，6周齡，質(zhì)量160～170 g，購于斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016—0002。大鼠在清潔級環(huán)境中分組分籠飼養(yǎng)，每天燈光照射12 h，室內(nèi)溫度(25±2) ℃，相對濕度55%±5%。給予充足飼料和飲用水，大鼠飼料購自斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2015—0015，飲用水為煮沸并恢復(fù)至室溫的自來水。所涉及的動物試驗均按北京農(nóng)學院動物福利與倫理委員會規(guī)定進行(批準號：BUAJDX2019001)。

1.2 主要材料

注射用鹽酸多柔比星(批號bzl020766)購于山西普德藥業(yè)有限公司，貝那普利(F5，批號34076)購于瑞士諾華制藥有限公司，心肌酶譜測試片(AST、ALT、LDH、CK批號分別為 6847513、4305921、4163275、6205317)購于愛德士生物科技公司。真空采血針(批號20170606)購于浙江康德萊醫(yī)療器械股份有限公司，肝素鋰抗凝真空采血管(批號19076101)購于河北鑫樂醫(yī)療器械科技股份有限公司，0.9%氯化鈉注射液(批號201901216)購于辰欣藥業(yè)股份有限公司。

1.3 動物處理

大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和貝那普利組，分別為10、15和15只大鼠。對照組大鼠在第1、8、15、22、29和36 天腹腔注射氯化鈉注射液，2 mL/kg質(zhì)量。模型組及貝那普利組大鼠采用阿霉素聯(lián)合冰水浴冷刺激法制作心陽虛大鼠模型：大鼠在第1、8、15、22、29和36 天腹腔注射2 mL/kg鹽酸多柔比星(主要成分為阿霉素，用前以氯化鈉注射液配成2 mg/mL)，總給藥量24 mg/kg質(zhì)量；注射鹽酸多柔比星期間，每天將大鼠置于冰水(0±2 ℃)中游泳3 min，每天1次，連續(xù)6周，冰水浴后用干毛巾將大鼠擦拭干凈。造模同時，模型組和貝那普利組大鼠分別每天灌胃等量飲用水和貝那普利，連續(xù)6周，經(jīng)口灌胃量按0.5 mL/100 g體質(zhì)量計算。根據(jù)犬貝那普利使用量5 mg/5～10 kg，按平均質(zhì)量換算得到大鼠貝那普利用量為0.3 mg/kg。造模期間，觀察各組大鼠臨床狀況。

1.4 檢測指標

1.4.1 心電圖及心率測定 各組大鼠每周進行1次心電圖檢測(第0、7、14、21、28、35和42天)。大鼠按0.3 mL/100 g質(zhì)量腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，麻醉前禁食12 h。待大鼠進入麻醉狀態(tài)將其仰臥固定于平臺上，四肢常規(guī)消毒后，用一次性無菌針灸針刺入右前肢及雙后肢皮下，使用多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠，型號RM6240)通過Ⅱ?qū)?lián)將生物電纜連接至大鼠肢體上的針灸針上。記錄每只大鼠3 min內(nèi)的心電圖波形，每隔2 min進行1次心率測定，共測定3次，計算平均值。

1.4.2 心肌酶檢測 試驗第42天，記錄各組大鼠心電圖后，對麻醉狀態(tài)下的大鼠進行常規(guī)消毒，隨后沿腹正中線剪開腹腔，暴露腹主動脈，用真空采血針采集1.5 mL血液，置于肝素鋰抗凝的真空采血管中，2 000 r/min離心10 min后取上清，應(yīng)用生化分析儀(愛德士生物科技公司，型號Catalyst Dx)進行心肌酶指標丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測。

1.4.3 心臟組織病理觀察 試驗第42天，各組大鼠采血后，通過腹主動脈放血處死大鼠，迅速摘取心臟并置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)方法包埋、切片(厚度為3～5 μm)和HE染色處理，使用光學顯微鏡(Olympus, 型號BX51)觀察制備好的切片并采集圖像。

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)主要以柱形圖+標準差表示，采用方差齊性檢驗和t-檢驗分析模型組與對照組或貝那普利組差異顯著性，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

造模結(jié)束后，模型組大鼠與對照組比較臨床表現(xiàn)出精神萎靡、活動量減少、畏縮扎堆、大便稀溏、體溫降低、采食量減少等虛寒癥狀。與模型組比較，貝那普利組大鼠臨床精神良好、較活躍、無畏縮扎堆、大便正常等，虛寒現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)(表1)。

表1 臨床觀察結(jié)果Tab.1 Results of clinical observation

2.2 心電圖ST段變化

與對照組比較，模型組大鼠心電圖ST段呈抬高趨勢，造模第35、42天，模型組大鼠ST段明顯抬高，差異極顯著(P<0.01)。貝那普利組大鼠與模型組比較ST段呈回落趨勢，用藥第7、14、35和42天，貝那普利組大鼠心電圖ST段明顯回落，差異顯著或極顯著(P<0.01/P<0.05)(圖1)。

2.3 心率變化

與對照組比較，模型組大鼠心率呈降低趨勢，造模第14、21、28、35和42天，模型組大鼠心率明顯降低，差異顯著或極顯著(P<0.05/P<0.01)。貝那普利組大鼠與模型組比較心率呈一定的增加趨勢，用藥第14、35天，貝那普利組大鼠心率明顯增加，差異極顯著(P<0.01)(圖2)。

2.4 心肌酶變化

與對照組比較，模型組大鼠心肌酶指標ALT、AST、CK、LDH均明顯升高，差異顯著或極顯著(P<0.05/P<0.01)。貝那普利組大鼠與模型組比較ALT、AST、LDH、CK均明顯降低，差異顯著或極顯著(P<0.05/P<0.01)(圖3)。

2.5 心臟組織病理學變化

對照組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，排列整齊。模型組大鼠M1中箭頭處可見心臟間質(zhì)單個核細胞浸潤；M2中箭頭處可見心肌細胞空泡變性；M3中上箭頭處可見心肌變性，下箭頭處有大量單個核細胞浸潤。貝那普利組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，排列整齊；F2、F3中箭頭處為心臟間質(zhì)單個核細胞浸潤(圖4)。

3 討 論

阿霉素是抗腫瘤藥物，因與心肌親和力較高，所以對心臟的毒性作用較大，常被用于制備動物心病模型。單用藥物可以損傷心肌，導致心功能減退，但難以體現(xiàn)虛寒的特點。余洪等以阿霉素結(jié)合低溫刺激方法(將動物置于-4 ℃至-2 ℃冰柜中)制作心陽虛模型，造模時間短，成功率高[8]。為進一步損傷陽氣，在余洪等基礎(chǔ)上對心陽虛模型進行了改良：阿霉素誘導不變，低溫刺激方法由原來的“氣冷”改為“水冷”(-2 ℃至2 ℃冰水浴游泳)。該法既可給予大鼠強烈的寒冷刺激，又可消耗體力，造成虛寒。結(jié)果表明心陽虛模型大鼠出現(xiàn)畏縮扎堆，大便稀溏，體溫降低等虛寒癥狀。應(yīng)用貝那普利后，大鼠精神狀態(tài)良好，被毛光澤，無畏縮扎堆，大便正常，采食量及活動量也增加，虛寒癥狀改善。

心電圖是臨床診斷心病的常用方法。通過心電圖波形變化可分析心律異常、心肌受損程度以及房室功能障礙等情況。心電圖ST段是QRS波群終點到T波開始前的一段，即心室去極化全部完成到快速復(fù)極化尚未開始的階段，正常情況處于等電位線上。ST段異常抬高提示心肌缺血和梗死，而且ST段抬高形態(tài)不同提示心肌缺血部位或損傷程度存在差異[9, 10]。模型組大鼠ST段從造模第7天開始呈抬高趨勢，在第35、42天時ST段異常抬高(P<0.01)，提示模型組大鼠心肌出現(xiàn)損傷。貝那普利組大鼠ST段從造模第7天開始呈回落趨勢，在第7、14、35和42天，ST段明顯回落(P<0.01/P<0.05)，提示貝那普利可有效對抗“阿霉素+水冷”刺激對心臟造成的損傷，與張瑾研究貝那普利降低冠心病患者心電圖ST段、改善心肌缺血損傷的結(jié)果一致[11]。

心率變化與心臟功能和疾病發(fā)展密切相關(guān)：急性心肌梗死后心率增快發(fā)生心絞痛幾率增加，而減慢心率可預(yù)防心絞痛的發(fā)生[12]；心率控制是冠心病心絞痛的重要治療手段，心率過低可誘發(fā)自發(fā)性心絞痛[13]；積極控制心率也可降低慢性心衰患者炎癥因子水平，改善心功能[14]。模型組大鼠從14天開始心率顯著降低(P<0.01/P<0.05)，這與普萘洛爾誘導心陽虛大鼠及甲狀腺全切除誘導陽虛兔等陽虛模型動物心率降低的結(jié)果一致[15,16]。貝那普利可顯著提高模型大鼠心率(P<0.01)，與其提高鏈脲佐菌素誘導的糖尿病模型大鼠心率的結(jié)果一致[17]。此外，貝那普利也可降低心力衰竭患者心率[18,19]。因此，貝那普利或?qū)π穆示哂须p向調(diào)節(jié)作用，其機制需進一步研究。

心肌酶是存在于心肌組織中的多種酶的總稱，主要包括LDH、CK、AST、ALT等。當心肌出現(xiàn)損傷時，心肌酶被釋放到血液中，使血漿中酶活力升高。模型組大鼠血漿LDH、CK、ALT、AST含量明顯升高(P<0.01/P<0.05)，提示模型組大鼠心肌出現(xiàn)了損傷。貝那普利顯著降低了大鼠ALT、AST、LDH、CK活性(P<0.01/P<0.05)，與其降低腫瘤藥致慢性心衰病人CK、LDH及充血性心衰模型犬LDH、CK、AST活性等結(jié)果相同[20,21]。

組織病理學檢查是疾病診斷及評價藥物毒理或療效的重要依據(jù)。阿霉素誘導的模型組大鼠心臟出現(xiàn)單個核細胞浸潤、心肌細胞空泡變性和心肌變性，與阿霉素誘導的急、慢性心臟毒性模型大鼠心肌病理學變化相似[22,23]；而貝那普利組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，排列整齊，僅心臟間質(zhì)有極輕度的單個核細胞浸潤，提示貝那普利對阿霉素誘導的心肌損傷具有保護作用。

綜上可知，貝那普利通過抑制心電圖ST段異常抬高、增加心率、降低心肌酶活性及改善心肌損傷減輕了“阿霉素+水冷”誘導的心陽虛模型大鼠的虛寒癥狀，對其具有良好的預(yù)防和保護作用。