鄭珍珍，黃 蕓

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206)

目前，乙烯調(diào)控果實(shí)成熟的研究主要集中在呼吸躍變型果實(shí)[1]，而在調(diào)控非呼吸躍變型果實(shí)成熟中的功能和機(jī)制尚不清楚。有報(bào)道用乙烯作用抑制劑1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)或乙烯利處理影響草莓果實(shí)成熟[2-3]。

乙烯響應(yīng)因子(ethylene response factor, ERF)屬于AP2/ERF(APETALA2/Ethylene-Responsive Factor)轉(zhuǎn)錄因子超家族，是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子超家族之一[4]，廣泛參與植株生長發(fā)育、果實(shí)發(fā)育和成熟、種子萌發(fā)等過程[5]。ERF亞族的蛋白至少含有1個(gè)行使DNA結(jié)合功能的AP2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含60～70個(gè)氨基酸殘基，由3個(gè)β折疊和1個(gè)α螺旋構(gòu)成[6]。

ERF轉(zhuǎn)錄因子參與乙烯調(diào)控果實(shí)成熟的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。有研究表明蘋果ERF017氨基酸突變影響果實(shí)成熟時(shí)葉綠素的降解過程[7]，草莓FaERF009可以通過激活呋喃酮氧化還原酶表達(dá)調(diào)控草莓芳香物質(zhì)的合成[8]。轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)獼猴桃ERF003可能調(diào)控果實(shí)軟化[9]，杏ERF003可能調(diào)控果實(shí)成熟過程中類胡蘿卜素的形成[10]。

草莓屬于薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)，由于其基因組較小，測序清楚，世代時(shí)間短，是研究果實(shí)成熟機(jī)制理想材料[11]。目前的研究發(fā)現(xiàn)草莓的果實(shí)發(fā)育時(shí)期主要受生長素和赤霉素調(diào)控，果實(shí)成熟主要受脫落酸(ABA)調(diào)控，乙烯是否調(diào)控草莓果實(shí)成熟及其中的機(jī)制問題亟待解決。就此通過分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等方法初步探究FaERF003在草莓果實(shí)成熟調(diào)控中的作用，為進(jìn)一步研究其生理功能，揭示乙烯調(diào)控非呼吸躍變型果實(shí)成熟機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

植物材料是北京農(nóng)學(xué)院溫室栽培的草莓(Fragaria×ananassa)品種‘紅顏’。栽培條件為：溫度17～26 ℃、相對濕度為60%～80%、光照14 h/黑暗10 h。選擇生長狀態(tài)良好的草莓進(jìn)行取樣。將草莓發(fā)育分為七個(gè)時(shí)期：小綠期、大綠期、褪綠期、白果期、始紅期、片紅期和全紅期。

RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全式金公司、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；核酸內(nèi)切酶、Q5高保真聚合酶購自NEB公司，無縫克隆試劑盒購自諾唯贊公司。所用引物均由北京生工生物有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 每個(gè)時(shí)期果實(shí)選取3個(gè)大小一致的果實(shí)樣本為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，去瘦果(種子)，切成0.5～0.8 cm3的小立方體，液氮速凍，在冷凍狀態(tài)下研磨樣品。RNA提取與反轉(zhuǎn)錄cDNA參照相關(guān)試劑盒說明書。

1.2.2 熒光定量 實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)檢測基因相對表達(dá)量，反應(yīng)體系參照Trans-Start Top Green qPCR Super Mix 試劑盒說明，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，10 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；循環(huán)45次。草莓FaERF003基因和內(nèi)參基因Actin[18]熒光定量引物如下：FaERF003-F: 5′ CCTCCTCCAGAAGTTCAGCG 3′，F(xiàn)aERF003-R: 5′ CATTTGCCCCAATGCCTCTG 3′；FaActin-F: 5′ GGCCAACCGTGAGAAGATG 3′，F(xiàn)aActin-R: 5′GTCCAGAGTCAAGAACAG3′。表達(dá)量檢測使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，上機(jī)結(jié)束后，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 ACC含量測量 精確稱取研磨好的樣品100 mg，加入氧化鋯珠，加入1 mL提取液(乙腈∶水=1∶1)，加入少量抗氧化劑，冰上提取4 h，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，取上清。之后分別用甲醇和氨水活化小柱，樣品經(jīng)過濃縮后，加入氨水溶液定容至2 mL后過小柱。用氨水溶液、氨水和甲醇溶液淋洗。加入0.2 mL甲醇溶解，上機(jī)進(jìn)行質(zhì)譜檢測，重復(fù)3次。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序分析 取大綠果期、白果期、始紅期和片紅期果實(shí)，去除瘦果，切成0.5～0.8 cm3的小立方體，液氮速凍，在冷凍狀態(tài)下研磨樣品。提取總RNA 2 μg 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。制備cDNA文庫后利用Illumina HiSeq 2000平臺進(jìn)行高通量測序。將測序得到的序列片段與參考基因組(ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Fragaria_vesca/)進(jìn)行匹配，根據(jù)FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)分析FaERF003在草莓果實(shí)不同時(shí)期的表達(dá)變化。

1.2.5 亞細(xì)胞定位 從GDR(https://www.rosaceae.org/)獲得FaERF003基因CDS序列，以‘紅顏’草莓果實(shí)cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增引物利用DNAMAN設(shè)計(jì)，序列如下：FaERF003 OE-F: 5′ CTGCAGGGGCCCGGGGTCGACATGGAAACAATG CAAGAAAATTACCTCC 3′，F(xiàn)aERF003 OE-R: 5′ CATGGTACCGGATCCACTAGTATTAGCAAGGACT TCCCAGATCAAC 3′。PCR反應(yīng)體系參照Q5高保真聚合酶說明書，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，5 min；95 ℃，15 s；55 ℃，15 s；72 ℃，1 min；循環(huán)32次；72 ℃，5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測正確后純化回收。使用SalⅠ和SpeⅠ內(nèi)切酶雙酶切pSuper-1300: GFP載體，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收載體片段，按照無縫克隆試劑盒說明書將載體與基因連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒測序正確后轉(zhuǎn)化入GV3101感受態(tài)細(xì)胞。篩選和擴(kuò)繁陽性克隆，制備農(nóng)桿菌侵染液，侵染煙草葉片。3 d后用激光共聚焦顯微鏡觀察FaERF003亞細(xì)胞定位，重復(fù)3次以上。

1.2.6 FaERF003生物信息學(xué)分析 利用ExPASy-Translate tool網(wǎng)站(https://web.expasy.Org/translate/)分析FaERF003基因序列及氨基酸序列，利用ExPASy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)分析FaERF003蛋白分子量(MW)和等電點(diǎn)(pI)等參數(shù)。利用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd)分析FaERF003蛋白保守結(jié)構(gòu)域[12]。從NCBI獲得FaERF003在其他植物中的同源ERF003蛋白序列，使用MEGA-7.0軟件構(gòu)建ERF003蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用Phyre2網(wǎng)站對FaERF003蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測與建模(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)[13]，使用Pymol軟件對FaERF003蛋白模型進(jìn)行標(biāo)注。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期ACC的含量

取5個(gè)發(fā)育時(shí)期的草莓果實(shí)進(jìn)行ACC含量測定發(fā)現(xiàn)(圖1)，在草莓果實(shí)發(fā)育初期ACC含量極低，隨著果實(shí)膨大到始紅期之前ACC含量緩慢增加，從始紅期到片紅期ACC含量急劇上升，此時(shí)的ACC含量約為始紅期3倍(3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，*表示P<0.001)。表明乙烯含量在果實(shí)成熟后期迅速升高，乙烯可能調(diào)控果實(shí)成熟后期的生理過程。

2.2 草莓FaERF003基因的表達(dá)模式

取草莓4個(gè)發(fā)育時(shí)期果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，得到草莓基因的FPKM值，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)基因號為FvH4_5g04470的基因，從大綠期到白果期表達(dá)顯著升高，白果期到始紅期變化不明顯，從始紅期到片紅期迅速升高(圖2，2個(gè)生物學(xué)重復(fù))。序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)儆贏P2/ERF家族，與乙烯響應(yīng)因子ERF003同源性較高，因此將其命名為FaERF003。為了驗(yàn)證FaERF003在不同果實(shí)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，熒光定量PCR試驗(yàn)檢測FaERF003從小綠到全紅相對表達(dá)變化，結(jié)果顯示該基因表達(dá)從小綠期到片紅期緩慢上升，在全紅期迅速上升(圖2，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，*表示P<0.001)。FaERF003表達(dá)變化趨勢與ACC含量變化相似(圖1)，暗示該基因可能參與乙烯調(diào)控草莓果實(shí)成熟的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

2.3 FaERF003基因克隆與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

以八倍體草莓‘紅顏’總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，克隆出FaERF003基因，全長為894 bp，編碼297個(gè)氨基酸，與二倍體草莓FvERF061(NCBI Reference Sequence: XM_004298847)相差4個(gè)堿基(圖3)。

根據(jù)FaERF003蛋白的氨基酸序列，利用NCBI網(wǎng)站的Blast功能搜索其他植物的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示二倍體草莓FvERF061與八倍體草莓FaERF003序列相似性最高，達(dá)99.55%；其次是月季(Rosachinensis)RcERF061蛋白(GenBank登錄號: XP_024168572.1)， 序列相似性為84.61%。

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得24種植物FaERF003同源蛋白的氨基酸序列，進(jìn)行同源性比對，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。其中薔薇科(Rosaceae)植物的ERF003同源蛋白親緣關(guān)系較近，在圖中聚為1支。

2.4 FaERF003生物信息學(xué)分析

利用ExPASy網(wǎng)站預(yù)測FaERF003蛋白的相對分子量MW= 32.9 kD，等電點(diǎn)pI=8.55，為堿性蛋白；負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)共33個(gè)，正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)共36個(gè)；穩(wěn)定性系數(shù)計(jì)算為40.15；親水性平均值為-0.499，表明該蛋白為親水性蛋白。

利用NCBI CD-Search分析FaERF003的功能保守結(jié)構(gòu)域(圖4-A)，F(xiàn)aERF003蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)其屬于AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子，包含ERF家族成員保守的DNA結(jié)合域。FaERF003的 DNA結(jié)合域由一個(gè)α-螺旋和3條反平行β-折疊帶構(gòu)成(圖 4-B)，這為FaERF003蛋白參與乙烯信號途徑，調(diào)控下游基因表達(dá)奠定結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2.5 草莓FaERF003亞細(xì)胞定位

為了觀測FaERF003的亞細(xì)胞定位，進(jìn)行了煙草葉肉細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FaERF003融合綠色熒光蛋白主要在細(xì)胞核表達(dá)，同時(shí)在胞質(zhì)中也有一定表達(dá)。核內(nèi)綠色熒光能夠與細(xì)胞核染料DAPI的藍(lán)光重合(圖5)，說明FaERF003蛋白能定位于細(xì)胞核。細(xì)胞核定位為FaERF003行使轉(zhuǎn)錄因子的功能提供了空間基礎(chǔ)。

3 討 論

本研究從八倍體草莓‘紅顏’中克隆出FaERF003基因，分析表明FaERF003有AP2/ERF家族的保守DNA結(jié)合域。該基因的表達(dá)量從小綠期到始紅期果實(shí)著色緩慢上升，在果實(shí)成熟后期片紅到全紅期表達(dá)量迅速升高，并在全紅期達(dá)到最高。這與草莓果實(shí)的ACC含量變化趨勢相似，推測FaERF003基因的表達(dá)水平與草莓果實(shí)的乙烯含量相關(guān)，F(xiàn)aERF003基因參與果實(shí)的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)草莓果實(shí)成熟。

通過分析草莓與24個(gè)物種的ERF003同源蛋白的進(jìn)化關(guān)系發(fā)現(xiàn)，草莓與月季的親緣關(guān)系最近，并且同屬薔薇科的植物在進(jìn)化樹中聚為一支，說明薔薇科AP2/ERF家族蛋白較為保守。分析FaERF003蛋白的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，結(jié)果表明FaERF003蛋白符合AP2/ERF家族的典型特征[7, 14]，如蛋白不穩(wěn)定、親水且非分泌以及含有3個(gè)β折疊和1個(gè)α螺旋的DNA結(jié)合區(qū)，這為FaERF003蛋白作為乙烯響應(yīng)因子奠定結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

通過亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)FaERF003蛋白主要定位于細(xì)胞核，胞質(zhì)也有一定表達(dá)?；诂F(xiàn)有研究，AP2/ERF家族成員大多定位于細(xì)胞核，但也有例外，如蔓花生AP2/ERF家族Aradu.SE6Q0和Aradu.42 K79 這2個(gè)成員也在細(xì)胞核外有定位[14]。FaERF003蛋白的胞質(zhì)定位可能與乙烯響應(yīng)有關(guān)，乙烯含量升高時(shí)可能改變FaERF003的定位，促進(jìn)FaERF003向細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移，從而有利于乙烯信號傳遞。

FaERF003是否影響草莓果實(shí)成熟，在草莓果實(shí)成熟中如何發(fā)揮功能，是否受乙烯或者ABA調(diào)控，其定位改變是否受到翻譯后修飾等問題，都有待進(jìn)一步驗(yàn)證。之后的研究將從以下幾個(gè)方面進(jìn)行：利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和圓片溫育試驗(yàn)驗(yàn)證FaERF003的表達(dá)和定位是否受乙烯和ABA調(diào)控；通過酵母單雜、凝膠遷移等試驗(yàn)驗(yàn)證FaERF003轉(zhuǎn)錄因子功能；利用RNA干擾、過表達(dá)技術(shù)瞬時(shí)侵染草莓，通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因株系，分析草莓FaERF003在果實(shí)成熟中的功能，為乙烯調(diào)控草莓果實(shí)成熟的機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。