趙志顯，邢 凱*，常雪蕊，齊曉龍，盛熙暉，倪和民， 王相國(guó)，肖龍菲，王楚端，郭 勇

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193)

miRNAs是一段長(zhǎng)18～22nt的微小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，它在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。基因表達(dá)調(diào)控是通過(guò)與靶mRNAs的不完全堿基配對(duì)來(lái)完成的，導(dǎo)致mRNA的降解或抑制蛋白翻譯，使mRNA指導(dǎo)蛋白的合成受到干擾[1]。miRNAs由哺乳動(dòng)物基因組的1%～5%組成，生物信息學(xué)分析顯示，超過(guò)60%的哺乳動(dòng)物基因可能被單個(gè)miRNA作為靶標(biāo)。細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的miRNAs都被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織的基因表達(dá)。由于更廣泛的靶向能力，miRNAs還被發(fā)現(xiàn)參與了大多數(shù)生物過(guò)程和細(xì)胞途徑[2]。有研究表明，豬的脂肪沉積受多個(gè)miRNA和基因的調(diào)控，并通過(guò)改變與脂肪沉積相關(guān)的信號(hào)通路而發(fā)揮作用。劉玉芳等[3]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α(PPARGC1A)基因能夠負(fù)調(diào)控豬脂肪沉積過(guò)程。王穎萍[4]研究表明ssc-miR-4332、ssc-miR-4338、ssc-miR-127、ssc-miR-424為脂肪沉積過(guò)程的負(fù)調(diào)控因子, ssc-miR-194、ssc-miR-545、ssc-miR-22為豬脂肪沉積過(guò)程的促進(jìn)因子。

miR-17-3p高表達(dá)于多發(fā)性骨髓瘤病人[5]和結(jié)腸癌患者[6]，在胃間質(zhì)瘤[7]和尋常型銀屑病患者皮損及外周血[8]中表達(dá)下調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，miR-17-3p及其靶基因可以調(diào)控豬卵巢從卵泡期向黃體期的發(fā)育過(guò)程。miR-17-3p等組成的miR-17簇在脂肪細(xì)胞分化的克隆擴(kuò)增階段顯著上調(diào)[10]。此外，miR-17-3p在3T3-L1細(xì)胞系成脂分化中發(fā)揮了作用[11]。然而，可能針對(duì)ssc-miR-17-3p轉(zhuǎn)錄并調(diào)控豬脂肪沉積的靶基因和信號(hào)通路尚無(wú)研究。因此，當(dāng)前的研究旨在使用生物信息學(xué)分析方法鑒定ssc-miR-17-3p候選靶基因及調(diào)控脂肪沉積的候選靶基因，更加深入的了解microRNA對(duì)脂肪沉積的所作用的機(jī)制，為豬的育種與培育提供更有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 miRNAs序列相似性分析

根據(jù)NCBI中的序列，進(jìn)行保守性分析，獲得miR-17-3p在各個(gè)物種的參考序列，分析各個(gè)物種與豬 miR-17-3p之間的序列相似性。miRNA在不同的哺乳動(dòng)物物種中得到了廣泛的保存，因?yàn)檫@一特性所以能夠使用人類miRNA引物來(lái)研究與豬相同的miRNA，在軟件中進(jìn)行相關(guān)候選靶基因預(yù)測(cè)。

1.2 預(yù)測(cè)miR-17-3p候選靶基因

采用miRDB(http://mirdb.org)[12]，miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)[13]和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)[14]3個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)hsa-miR-17-3p進(jìn)行候選靶基因預(yù)測(cè)。采用Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)[15]在線軟件對(duì)上述3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的候選靶基因取交集。3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的共同候選靶基因與已得到的371個(gè)與豬脂肪相關(guān)的差異表達(dá)基因[16]再次取交集，從中篩選出一部分參與脂肪沉積的候選靶基因。

1.3 KEGG/GO功能富集分析和潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)繪制

采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[17]在線數(shù)據(jù)軟件獲得miR-17-3p候選靶基因參與的KEGG/GO通路，采用R語(yǔ)言軟件對(duì)獲得的候選靶基因進(jìn)行KEGG/GO功能富集分析。

對(duì)篩選出的參與脂肪沉積的候選靶基因進(jìn)行如下分析：采用KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/genelist/)[18]在線數(shù)據(jù)軟件獲得候選靶基因參與的通路，然后采用Cytoscape(https://cytoscape.org/)可視化工具進(jìn)行潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)繪制。

2 結(jié)果

2.1 miRNAs序列相似性分析結(jié)果

獲得了豬及其他多個(gè)物種miR-17-3p引物序列，進(jìn)行了序列相似性研究，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，豬miR-17-3p引物序列與人和一部分嚙齒類動(dòng)物序列完全一樣(表1)。

2.2 miR-17-3p候選靶基因預(yù)測(cè)與功能富集分析結(jié)果

通過(guò)預(yù)測(cè)hsa-miR-17-3p候選靶基因，在miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到了657個(gè)候選靶基因；在miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到了12 986個(gè)候選靶基因；在TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到了5 541個(gè)候選靶基因。通過(guò)Venny取交集，得到了3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的486個(gè)共同候選靶基因。通過(guò)對(duì)486個(gè)共同候選靶基因做KEGG/GO功能富集分析，DAVID結(jié)果顯示,在KEGG通路中，候選靶基因參與了36個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包括碳水化合物的消化吸收、胰高血糖素信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等，部分結(jié)果見(jiàn)圖1。在GO聚類中，候選靶基因參與了159個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包括脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、琥珀酸代謝過(guò)程、核、蛋白質(zhì)結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等，部分結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 miR-17-3p潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

miR-17-3p是通過(guò)高通量測(cè)序在不同背膘厚度長(zhǎng)白豬脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)差異表達(dá)miRNA，且在背膘組中顯著高表達(dá)。在同樣的樣本中，發(fā)現(xiàn)了371個(gè)差異表達(dá)的基因[16]。其中13個(gè)靶基因也在差異表達(dá)基因列表中，包括TSTD2、CSDE1、SCGB1D1、TEAD1、GPD2、NFATC3、MBNL1、PPP1R12B、CAMK2D、HBEGF、LRRC28、UBE2D4、MAP4。在這13個(gè)重點(diǎn)候選靶基因中， CSDE1、TEAD1、GPD2、NFATC3、MBNL1、PPP1R12B、CAMK2D、HBEGF參與了脂肪代謝的過(guò)程。其中GPD2參與了脂質(zhì)代謝、甘油磷脂代謝，糖醇代謝等過(guò)程；CAMK2D參與了催產(chǎn)素信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路，胰高血糖素信號(hào)通路等；HBEGF參與了GnRH信號(hào)通路，磷代謝過(guò)程，甲狀旁腺激素的合成，分泌和作用等；其他基因參與了大分子代謝過(guò)程，細(xì)胞代謝過(guò)程等(圖3)。

3 討 論

在對(duì)13個(gè)重點(diǎn)候選靶基因做功能富集分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)催產(chǎn)素信號(hào)通路顯著富集，有研究表明[19]，催產(chǎn)素(OXT)直接作用于脂肪細(xì)胞上的OXT受體，來(lái)抑制白色脂肪到米色脂肪轉(zhuǎn)變基因程序，白色脂肪細(xì)胞的褐化(也稱為米色細(xì)胞)被證明是通過(guò)消耗儲(chǔ)存的脂質(zhì)來(lái)執(zhí)行產(chǎn)熱作用的，這與代謝動(dòng)態(tài)平衡高度相關(guān)[29]。而注射OXT可能會(huì)通過(guò)對(duì)OXT能神經(jīng)元的作用而減少體內(nèi)總脂肪。此外，McCormack S E等[20]在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，缺乏OXT信號(hào)的小鼠表現(xiàn)出胰島素敏感性降低和葡萄糖漂移增加，而缺乏OXT受體的小鼠腹部脂肪墊增厚和甘油三酯增加。對(duì)于GnRH信號(hào)通路，王作偉等[21]的GnRH主動(dòng)去勢(shì)免疫公豬試驗(yàn)表明，GnRH主動(dòng)免疫使公豬肝臟脂肪合成能力增強(qiáng)，與傳統(tǒng)手術(shù)去勢(shì)公豬相比，脂肪合成能力降低，瘦肉率提高。Mackay J等[22]用含GnRH類似蛋白結(jié)合物的疫苗接種公豬，能夠使脂肪中不飽和脂肪酸的含量提高。促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其家族控制著各種重要的生理性過(guò)程,包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖、死亡。MAPK信號(hào)通路在脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中起著非常重要的作用,能直接影響脂肪因子、脂肪細(xì)胞分化基因的表達(dá)[23]。

ssc-miR-17-3p候選靶基因中，3-磷酸甘油脫氫酶(GPD2)，可以催化3-磷酸甘油酯轉(zhuǎn)化為磷酸二羥基丙酮酯。GPD2與GDP1一起構(gòu)成了磷酸甘油酯穿梭反應(yīng)。Kim Y H等[24]在人絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化過(guò)程中的基因表達(dá)譜試驗(yàn)中將GPD2作為標(biāo)志基因，用于檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化。鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IIδ(CAMK2D) 的產(chǎn)物屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，并屬于Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶亞家族。研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖大鼠中，細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用的CAMK2D表達(dá)上調(diào)[25]。肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)是EGF家族中的一個(gè)肝素結(jié)合成員，被發(fā)現(xiàn)于人巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液的中間產(chǎn)物中，因與肝素有很強(qiáng)的結(jié)合力而得名[26]。可溶性成熟的HB-EGF是由較大的膜錨定前體蛋白水解而成，對(duì)成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞是一種有效的有絲分裂原和趨化因子[27]。Matsumoto S等[28]研究表明，HB-EGF mRNA在人脂肪組織中大量表達(dá)，肥胖小鼠脂肪組織中HB-EGF mRNA表達(dá)增加，人血漿HB-EGF水平隨脂肪堆積而升高。此外Hung C S等[29]研究表明，MBNL1自身調(diào)節(jié)參與了整個(gè)米色脂肪形成過(guò)程中MBNL1轉(zhuǎn)錄本的剪接過(guò)程。

綜上所述，ssc-miR-17-3p可能通過(guò)調(diào)控GPD2、CAMK2D、HB-EGF、MBNL1等候選靶基因，進(jìn)而參與豬脂肪細(xì)胞的生成、分化和代謝，以及調(diào)控催產(chǎn)素信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。通過(guò)這些發(fā)現(xiàn)，將有力支持ssc-miR-17-3p參與豬脂肪沉積調(diào)控機(jī)制的探索。