陳書秀，孫 娟，李 霞，趙 楠，史 良，李曉捷

(山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點實驗室，山東 煙臺 264003)

籠目海帶(KjellmaniellacrassifoliaMiyabe)，又稱厚葉切氏海帶、厚葉解曼藻，屬于褐藻門、褐藻綱、海帶目、海帶科，主要分布于日本北海道函館和室蘭的深水區(qū)[1]?；\目海帶含有豐富的巖藻多糖，其含量比普通海帶高，且其他雜糖含量相對較少，因此是提取巖藻多糖的重要原料。巖藻多糖具有調(diào)節(jié)血脂、降血糖、降血壓、抗腫瘤等生物活性[2]。

籠目海帶是一種大型褐藻，一般在冬季和初春進(jìn)行生長和繁殖，研究其生長發(fā)育與環(huán)境條件的關(guān)系，有利于提高養(yǎng)殖效益，優(yōu)化養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)等。國內(nèi)外學(xué)者對環(huán)境因子如溫度、光照、營養(yǎng)鹽與海帶生長發(fā)育關(guān)系做了一系列的研究[3-8]，但關(guān)于光對籠目海帶生長發(fā)育的影響尚未見報道。光強(qiáng)對海帶屬種類的生長發(fā)育有較大的影響，低溫弱光條件下會長期處于配子體階段，改變生長環(huán)境條件，恢復(fù)合適的光照強(qiáng)度，海帶配子體可以正常發(fā)育形成配子體并產(chǎn)生孢子體[9]，海帶有孢子體階段能夠耐受較高的光強(qiáng)，隨孢子體的變大，其耐受的光照強(qiáng)度減弱[10]。藻類配子或孢子的發(fā)生還受光周期的影響，如柏桉藻(Bonnemaisoniahamifera)以隱藏孢子體的狀態(tài)越夏，在秋冬季短日照時產(chǎn)生孢子；杉藻(Gigartinaacicularis)的雌雄配子體僅在日照短于12 h時形成；礁膜(Monostromagrevillei)的孢子的產(chǎn)生也受光周期的控制[11]。

本研究以籠目海帶雌、雄配子體為材料，通過顯微觀察配子體生長發(fā)育狀態(tài)，計算配子體發(fā)育率等，探究不同光照強(qiáng)度及光照周期對籠目海帶配子體生長發(fā)育的影響，以期為籠目海帶配子體克隆育苗技術(shù)提供理論支持，為其進(jìn)一步擴(kuò)大養(yǎng)殖奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及培養(yǎng)方法

籠目海帶配子體保存條件為溫度10℃，鹽度31，光照強(qiáng)度10 μmol·m-2s-1，24 h光照。取適量的雌雄配子體分別用300目篩絹過濾，獲得含2～5個細(xì)胞的細(xì)胞段懸濁液，然后按照細(xì)胞密度2∶1的比例將雌雄配子體混合均勻，取10 mL懸濁液加入到12 cm(直徑)的培養(yǎng)皿中，放置在不同的光照強(qiáng)度、光照周期下進(jìn)行培養(yǎng)。在海水中添加NaNO3、KH2PO3、檸檬酸鐵作為培養(yǎng)液，總有效氮為2 mg/L，有效磷為0.2 mg/L，有效鐵為0.05 mg/L。設(shè)置不同的光照強(qiáng)度和光照周期進(jìn)行單因子實驗，每個處理組設(shè)置3個重復(fù)。

根據(jù)常見養(yǎng)殖海帶品種對光的適應(yīng)性[10，12]，本實驗將光照強(qiáng)度(光照周期均為10L∶14D)設(shè)置為：5、10、20、30、40、60、80、100、120 μmol·m-2s-1。光照周期(光照強(qiáng)度均為15 μmol·m-2s-1)設(shè)置為L/D：6∶18、10∶14、12∶12、16∶8、20∶4。

1.2 配子體生長、發(fā)育指標(biāo)的測定

在顯微鏡下觀察配子體的生長發(fā)育狀態(tài)，每3天拍照1次，實驗周期30 d。

配子體發(fā)育率的計算：每個培養(yǎng)皿隨機(jī)觀察10個100×視野，分別統(tǒng)計卵囊形成、排卵、幼孢子體和總細(xì)胞數(shù)，按卵囊形成數(shù)、排卵數(shù)和孢子體數(shù)之和占總細(xì)胞數(shù)的百分比計算發(fā)育率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0軟件對發(fā)育率進(jìn)行單因子方差分析、多重比較(P<0.05表示差異顯著)。用Excel軟件作圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同光照強(qiáng)度對籠目海帶配子體發(fā)育的影響

從圖1可以看出，籠目海帶配子體在光照強(qiáng)度范圍為5～100 μmol·m-2s-1條件下均可進(jìn)入生殖生長階段，均出現(xiàn)卵囊、排卵及孢子體(圖2d、e、f)。單因子方差分析結(jié)果表明，光照強(qiáng)度對籠目海帶配子體發(fā)育率有顯著影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果如圖3所示，培養(yǎng)天數(shù)為15 d時，60 μmol·m-2s-1條件下發(fā)育率(11.06%)顯著高于其他組。培養(yǎng)到第19天 ，各組的孢子體數(shù)目顯著增加，20～40 μmol·m-2s-1光照強(qiáng)度條件下發(fā)育率(42.15%～51.72%)顯著高于其他組。培養(yǎng)后期，除高光強(qiáng)100～120 μmol·m-2s-1條件下發(fā)育率(42.39%、13.33%)顯著低于其他組外，其余光照強(qiáng)度條件下，發(fā)育率差異不顯著。

2.2 不同光照周期對籠目海帶配子體發(fā)育的影響

從圖4可以看出，籠目海帶配子體在5個不同光照周期條件下均可進(jìn)入生殖生長階段，均出現(xiàn)卵囊、排卵及孢子體(圖2d、e、f)。單因子方差分析結(jié)果表明：光照周期對籠目海帶配子體發(fā)育率有顯著影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果(圖5)表明，培養(yǎng)第12～25天時，16L∶8D、20L∶4D光照周期條件下發(fā)育率(6.68%～69.87%、6.64%～76.71%)顯著高于其他組。培養(yǎng)第28～32天，6L∶18D條件下發(fā)育率(23.90%、43.95%)顯著低于其他組以外，其余組之間的差異不顯著，發(fā)育率均可達(dá)到60%～80%，其中，光照時間最長的處理組即20L∶4D的發(fā)育率(74.54%)最高且孢子體細(xì)胞列數(shù)最多(圖5)。

注：A1、A2、A3分別為6L∶18D第19天、第25天、第32天；B1、B2、B3分別為10L∶14D第19天、第25天、第32天；C1、C2、C3分別為12L∶12D第19天、第25天、第32天；D1、D2、D3分別為16L∶8D第19天、第25天、第32天；E1、E2、E3分別為20L∶4D第19天、第25天、第32天。

注：柱狀圖上小寫字母下標(biāo)相同數(shù)字的為同一組多重個比較，同一組的不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

藻類對光照強(qiáng)度的需求有一個適宜范圍(即補(bǔ)償光照強(qiáng)度和飽和光照強(qiáng)度之間)，在此適光范圍內(nèi)，光照強(qiáng)度增加，光合作用加快，從而有利于生物量的增加；超過光飽和強(qiáng)度后，光合作用反而減弱以致受到抑制。本實驗結(jié)果表明，光照強(qiáng)度對籠目海帶配子體的發(fā)育有顯著的影響，籠目海帶配子體發(fā)育的最適光照強(qiáng)度為20～40 μmol·m-2s-1。國內(nèi)外專家也做了其他海帶配子體的相關(guān)研究，楊迎霞等[13]研究結(jié)果表明，在4 500 lx光照強(qiáng)度，充氣懸浮培養(yǎng)條件下，海帶配子體克隆具有較高的瞬時生長率。孫娟等[14]研究表明，多肋藻雌配子體培養(yǎng)光照強(qiáng)度應(yīng)保持在1 000 lx左右，雄配子體培養(yǎng)光照強(qiáng)度在2 000 lx左右為宜。Lee[15]的研究表明，當(dāng)光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2s-1時，皺海帶(L.relifiosa)配子體的繁殖率達(dá)到最大。Lüning K等[16]研究表明通常條件下海帶配子體在充足光照下會進(jìn)入生殖生長階段，在低光下則維持營養(yǎng)生長狀態(tài)。

本次實驗結(jié)果表明，在15 μmol·m-2s-1光照強(qiáng)度條件下，較長的光照時間(16L∶8D、20L∶4D)有利于促進(jìn)配子體的生殖生長進(jìn)程，促進(jìn)卵囊的形成、受精卵的排放及孢子體的生長。張鑫等[17]研究了不同光照周期對羊棲菜有性繁殖過程的影響，結(jié)果表明，長光照周期可以明顯促進(jìn)卵子的排放，延長卵子的存活時間，提高卵子的受精效率，有利于合子的發(fā)育與生長。除此之外，光質(zhì)、營養(yǎng)鹽、溫度等也是影響海帶配子體生長發(fā)育的重要因素。如隋曉偉等[18]研究表明光質(zhì)對海帶配子體的生長和發(fā)育具有顯著的影響，促進(jìn)作用最大的是藍(lán)光，其次是綠光，紅光可抑制配子體的發(fā)育。鞠青等[19]研究表明N∶P>15∶1時會降低海帶配子體的形成；王軍等[20]研究也表明利尻海帶在10℃條件下，雌、雄配子體的成熟度最高；在20℃條件下，配子體不發(fā)育。Martins N等[21]發(fā)現(xiàn)掌狀海帶配子體生長的最適溫度范圍為10～18℃，而發(fā)育的最適溫度范圍為5～15℃。Schreiber E[22]研究表明糖海帶配子體生長的最適溫度范圍為13～18℃，而發(fā)育的最適溫度為6℃。

另外，各種環(huán)境因子對海帶配子體的生長發(fā)育的影響一般存在著交互作用，如皺海帶配子體發(fā)育過程中，在光照適宜和營養(yǎng)鹽充足的條件下，溫度對配子體的發(fā)育影響不顯著[23]。王軍等[20]研究也表明了溫度是影響利尻海帶配子體成熟的主要因子，照度只是個輔助因子。王瀟等[24]研究表明鐵和氮磷對海帶 ‘黃官1號’配子體的營養(yǎng)生長和生殖生長具有協(xié)同促進(jìn)作用，鐵是海帶配子體由營養(yǎng)生長到發(fā)育成熟再到有性生殖過程中的關(guān)鍵因素。因此，進(jìn)一步深入研究各環(huán)境因子對籠目海帶配子體生長發(fā)育的影響是利用籠目海帶配子體育苗的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

本文僅利用單因子實驗研究了光照強(qiáng)度及光照周期對籠目海帶配子體生長發(fā)育的影響，結(jié)果表明在光照周期為10L∶16D條件下，籠目海帶配子體發(fā)育的最適光照強(qiáng)度為20～40 μmol·m-2s-1；在光照強(qiáng)度為15 μmol·m-2s-1條件下，籠目海帶配子體發(fā)育的最適光照周期為16L∶8D、20L∶4D。

綜上可知，各種環(huán)境因子對海帶配子體的生長發(fā)育的影響一般存在著交互作用，因此，在籠目海帶配子體育苗過程中需要進(jìn)行多方面的考慮，以期達(dá)到最好的育苗效果。