譚中林，鄧思紅，陳修松，徐大勇，何學(xué)福

(1.涼山科華水生態(tài)工程有限公司，四川 西昌 615013；2.喜德正源水產(chǎn)有限公司，四川 西昌 615013；3.西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013；4.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400000)

鱸鯉(Percocyprispingi)屬于鯉形目、鯉科、鲃亞科、鱸鯉屬，又名花魚(yú)、青脖、花鯉，在四川境內(nèi)僅有一種，主要分布于四川的岷江、青衣江、馬邊河(岷江支流)、金沙江下段、雅礱江、烏江等水系，是四川省珍貴的魚(yú)類(lèi)之一，也是四川省重點(diǎn)保護(hù)的魚(yú)類(lèi)之一。鱸鯉個(gè)體較大，體質(zhì)量一般為1～3 kg，野外漁獲中最大個(gè)體質(zhì)量達(dá)到16.5 kg。鱸鯉為肉食性?xún)疵汪~(yú)類(lèi)，魚(yú)肉口感鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，又有很高的藥用價(jià)值和保健作用，為上等優(yōu)質(zhì)食用魚(yú)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

近幾十年來(lái)，隨著長(zhǎng)江上游新一輪水電大開(kāi)發(fā)和水利樞紐工程的修建，鱸鯉的產(chǎn)卵場(chǎng)不復(fù)存在，其索餌場(chǎng)也遭到了極大的破壞，再加之其生態(tài)環(huán)境的日益惡化以及人為的過(guò)度捕撈等因素，鱸鯉的資源量急劇下降，瀕臨絕滅。目前，該種魚(yú)的人工繁殖與增養(yǎng)殖已引起重視，國(guó)內(nèi)學(xué)者們已對(duì)其某些生物學(xué)特性以及養(yǎng)殖技術(shù)方面做了大量的工作[1-24]，但關(guān)于鱸鯉的精子生理特性未見(jiàn)報(bào)道，而研究這種魚(yú)的精子生物學(xué)和了解其精子壽命，在理論與生產(chǎn)上均具有一定的意義。為此，本文就氯化鈉溶液對(duì)精子活力的影響做了初步觀察，旨在了解在不同的滲透壓條件下鱸鯉精子的生理特性，積累鱸鯉精子的生物學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年4月6日，精液取自江河幼魚(yú)經(jīng)涼山州喜德正源水產(chǎn)有限公司內(nèi)塘養(yǎng)殖的成熟健康的鱸鯉親魚(yú)。選取繁殖季節(jié)體格健壯、外無(wú)損傷、輕擠腹部精液自動(dòng)流出的成熟雄魚(yú)，魚(yú)體質(zhì)量2.0～6.0 kg，體長(zhǎng)460～550 mm。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

用氯化鈉加蒸餾水配制不同百分比濃度的溶液：0%(蒸餾水)、0.10%、0.20%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%、0.55%、0.60%、0.65%、0.70%、0.90%。溶液水溫為18.0℃，pH 6.5～7.5。

1.2.2 精液采集

每次取材前先用干布將其生殖孔周?chē)粮桑p擠魚(yú)腹兩側(cè)，精液盛于小培養(yǎng)皿中，加蓋待檢。要求采集的精液無(wú)水、無(wú)尿、無(wú)血。

1.2.3 精子觀察

采用平板載片法，用吸管滴一滴氯化鈉溶液在平板載片上，調(diào)節(jié)好顯微鏡。然后用解剖針尖蘸取少許精液與氯化鈉溶液調(diào)勻，立即移至10×10倍顯微鏡下觀察記錄其精子活動(dòng)情況。以精液與溶液接觸的瞬間開(kāi)始啟動(dòng)秒表來(lái)計(jì)錄精子活動(dòng)的時(shí)間，室溫為16.4～19.4℃，每個(gè)濃度組重復(fù)6次。

1.2.4 精子群體運(yùn)動(dòng)階段的劃分

精子群體運(yùn)動(dòng)階段的劃分參照吳景貴[25]的方法。根據(jù)鱸鯉精子在水中的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，可以分為激烈運(yùn)動(dòng)、緩慢運(yùn)動(dòng)、搖尾運(yùn)動(dòng)三個(gè)連續(xù)的階段。這三個(gè)階段時(shí)間的總和即為精子的壽命。各階段的具體劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：

1)激烈運(yùn)動(dòng)：自精液與溶液相遇的瞬間開(kāi)始，在10×10倍鏡面下只見(jiàn)到翻動(dòng)的黑點(diǎn)，看不清精子的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)路線(xiàn)。

2)緩慢運(yùn)動(dòng)：精子向前運(yùn)動(dòng)，速度較慢，能分清其運(yùn)動(dòng)路線(xiàn)。

3)搖尾運(yùn)動(dòng)：精子失去前進(jìn)運(yùn)動(dòng)能力，只能在原地做微弱搖尾擺動(dòng)，直到停止運(yùn)動(dòng)而死亡。

以視野中約70%精子由前一運(yùn)動(dòng)階段轉(zhuǎn)為后一運(yùn)動(dòng)階段時(shí)，即認(rèn)為該批精子前一運(yùn)動(dòng)階段的終結(jié)和后一運(yùn)動(dòng)階段的開(kāi)始。搖尾運(yùn)動(dòng)階段的終了，精子運(yùn)動(dòng)停止，即90%以上精子都停止活動(dòng)而死亡。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析采用Excel和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

不同濃度氯化鈉溶液中鱸鯉精子各階段的持續(xù)時(shí)間不同，具體詳見(jiàn)表1。

表1 鱸鯉精子在不同濃度氯化鈉溶液中各個(gè)階段的持續(xù)時(shí)間

續(xù)表1

當(dāng)氯化鈉溶液濃度為0%～0.35%時(shí)，鱸鯉精子壽命隨氯化鈉溶液濃度升高而相對(duì)延長(zhǎng)。在濃度為0.35%時(shí)激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和精子壽命最長(zhǎng)，分別為(66.33±7.99)s、(635.66±95.78)s。在氯化鈉溶液濃度超過(guò)0.35%后，精子的活動(dòng)強(qiáng)度減弱，存活時(shí)間縮短。當(dāng)氯化鈉溶液濃度達(dá)0.70%時(shí)，精子活動(dòng)受到嚴(yán)重抑制，觀察不到被激活的精子。由此可見(jiàn)，氯化鈉溶液對(duì)鱸鯉精子活力具有影響。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，當(dāng)氯化鈉溶液濃度為0.35%時(shí)，鱸鯉精子的激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間僅顯著高于0.60%組和0.65%組(P<0.05)，而與其余各組之間差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)氯化鈉溶液濃度為0.35%時(shí)，鱸鯉精子的壽命極顯著高于其他處理組(P<0.01)；當(dāng)氯化鈉濃度為0.40%時(shí)，鱸鯉精子的壽命極顯著高于除0.35%處理組外的其余處理組(P<0.01)。

3 討論

滲透壓是影響?hù)~(yú)類(lèi)精子激活和活力的眾多因素中最關(guān)鍵的影響因子[26-27]。一般認(rèn)為淡水魚(yú)類(lèi)精子的激活是由低滲環(huán)境所致，并且存在精子活動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)的最適滲透壓[28-29]。體外受精的魚(yú)類(lèi)精子儲(chǔ)存的能量有限，一旦被激活，一般只有幾十秒至幾分鐘就被消耗完。這種精子的短暫運(yùn)動(dòng)與精子新陳代謝、細(xì)胞的興奮性和滲透壓的調(diào)節(jié)有關(guān)[30]。鱸鯉精子同其他魚(yú)類(lèi)的精子一樣，在精巢中是不活動(dòng)的，一旦與適合精子活動(dòng)的溶液接觸就會(huì)被激活而開(kāi)始激烈運(yùn)動(dòng)，其最具有受精意義的時(shí)相是激烈運(yùn)動(dòng)階段。隨著本身能源物質(zhì)的消耗，運(yùn)動(dòng)速度逐漸轉(zhuǎn)慢，最后完全失去運(yùn)動(dòng)能力，細(xì)胞隨之死亡、分解。

對(duì)于生物來(lái)說(shuō)，決定體液濃度的主要物質(zhì)是鹽分。換句話(huà)說(shuō)，體液的滲透壓比較高就是指體液里鹽分的濃度比較高。通常淡水中的滲透壓非常低，這是因?yàn)樗谢緵](méi)有溶入鹽分，所以淡水魚(yú)類(lèi)體液的鹽分濃度一般比外界水環(huán)境要高些，系高滲性溶液，而淡水本身則接近于零。當(dāng)鱸鯉的精子接觸淡水后勢(shì)必消耗大量的能量來(lái)抵抗外界水的滲入，這就加快了其精子的死亡。在淡水中添加氯化鈉，則可以提高溶液的滲透壓，使其盡可能接近鱸鯉精子本身的滲透壓，進(jìn)而延長(zhǎng)精子壽命，提高受精率。從上述分析比較可以得出：當(dāng)氯化鈉溶液濃度為0.35%時(shí)，鱸鯉精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命最長(zhǎng)，因而在生產(chǎn)實(shí)踐中配制鱸鯉精子激活劑時(shí)，0.35%氯化鈉溶液可作為參考值，以延長(zhǎng)精子活力，保持精子的激烈運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。同時(shí)，當(dāng)氯化鈉溶液濃度為0.35%時(shí)，鱸鯉精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間雖然最長(zhǎng)，但除與0.60%和0.65%差異顯著外，和其他處理組均差異均不顯著，參考鄧岳松等關(guān)于魚(yú)類(lèi)精子活力的研究進(jìn)展，體外受精魚(yú)類(lèi)的精子活力不僅與自身質(zhì)量有關(guān)，還受到pH、滲透壓、溫度及離子等因子的調(diào)節(jié)和影響[31]，究竟哪種因子能夠顯著影響鱸鯉精子活力尤其是激烈運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，有待進(jìn)一步研究。Morisawa等[32]在研究鯉(Cyprinuscarpio)、鯽(Carassiusauratus)、歐鯽(Carassiuscarassius)和兩種雅羅魚(yú)(Leuciscus)精子活動(dòng)中指出，鯉科魚(yú)類(lèi)精子在與其精漿等滲的電解質(zhì)(NaCl或KCl)或非電解質(zhì)(甘露糖或葡萄糖)溶液中是不活動(dòng)的，精漿的滲透壓濃度是抑制精子活動(dòng)的因子。當(dāng)氯化鈉溶液濃度大于0.70%時(shí)，鱸鯉精子不活動(dòng)，由此推測(cè)與鱸鯉精漿等滲的氯化鈉濃度為0.70%，故該結(jié)果可作為鱸鯉精子保存液的參考值。