中南大學(xué)

生命科學(xué)學(xué)院

湖南 長(zhǎng)沙 410013

0 引言

T4多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 PNK）于1965年被發(fā)現(xiàn)，可以催化γ-磷酸從三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）轉(zhuǎn)移到核酸分子的5’-OH末端[1-2]。研究表明T4 PNK活性與核酸的復(fù)制、重組、修復(fù)密切相關(guān)[3-5]。異常T4 PNK行為會(huì)抑制由于DNA異?；驌p傷而引發(fā)的細(xì)胞免疫，從而引起人類患病如Werner綜合癥、Loom’s 綜合癥和Rothmund-Thomson 綜合癥等重大疾病[6]。因此，T4 PNK在開發(fā)藥物、疾病診斷等方面均具有重要現(xiàn)實(shí)意義。有關(guān)T4 PNK的研究已經(jīng)引起研究人員的廣泛關(guān)注[7-10]。而發(fā)展檢測(cè)T4 PNK 活性的可靠、簡(jiǎn)單方法，更是當(dāng)下重要的研究方向之一。

傳統(tǒng)的檢測(cè)T4 PNK活性方法有放射自顯影法、放射性同位素32P標(biāo)記法以及聚丙烯酰胺凝膠電泳法等[11-12]。雖然這些方法的精確度較高、檢測(cè)豐度較低，但仍然存在一些缺陷，例如操作程序復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，甚至有潛在的輻射危害，這極大地限制了其應(yīng)用。為克服這些缺點(diǎn)，研究人員提出了電化學(xué)、熒光法、生物發(fā)光法和比色分析法等多種分析技術(shù)用于T4 PNK活性的高靈敏檢測(cè)[13-17]。在這些方法中，基于熒光的分析策略因其高靈敏度和操作簡(jiǎn)易受到了研究人員的廣泛青睞。Sun N.N.等[18]基于熒光標(biāo)記核酸探針開發(fā)了氧化石墨烯生物傳感平臺(tái)，該平臺(tái)能用于T4 PNK活性檢測(cè)。Tang Z.W.等[19]利用分子信標(biāo)探針和T4 DNA連接酶檢測(cè)DNA磷酸化。盡管上述研究人員在DNA磷酸化測(cè)定中做出了許多努力，但這些方法主要取決于熒光染料或特定染料標(biāo)記的核酸探針的使用，其中雙標(biāo)記分子信標(biāo)修飾成本較高，樣本穩(wěn)定性較差。由此可見，提高定量檢測(cè)T4 PNK活性的靈敏度、優(yōu)化檢測(cè)步驟和方法、降低檢測(cè)成本等將是研究人員研發(fā)T4 PNK檢測(cè)試劑盒時(shí)所面臨的挑戰(zhàn)性問(wèn)題。

近年來(lái)，生物傳感技術(shù)不斷發(fā)展，免標(biāo)記型熒光生物傳感器引起了研究人員的廣泛關(guān)注。免標(biāo)記型核酸探針的構(gòu)建避免了繁瑣的標(biāo)記過(guò)程及假陽(yáng)性等不利因素，該探針具有特異性較強(qiáng)、穩(wěn)定性較好，使樣品活性保持時(shí)間較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因而在生物傳感領(lǐng)域有很好的應(yīng)用潛力。Zhao H.等[20]基于單鏈納米銅熒光探針和核酸外切酶III（exonuclease III，Exo III）輔助的信號(hào)放大策略實(shí)現(xiàn)了多聚核苷酸激酶的免標(biāo)記檢測(cè)分析。Chen M.J.等[21]基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和G-四鏈體-ThT體系建立了前列腺抗原的免標(biāo)記熒光檢測(cè)方法。基于上述研究，本課題組利用功能核酸探針，基于G-四鏈體的熒光轉(zhuǎn)化，發(fā)展了一種對(duì)T4 PNK進(jìn)行高靈敏度和特異性檢測(cè)的免標(biāo)記熒光法。該方法的成功構(gòu)建可潛在地篩選T4 PNK抑制劑，為藥物發(fā)現(xiàn)和疾病治療提供有力工具。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

T4 PNK（10 U/μL）、λ核酸外切酶（λexo）均采購(gòu)自New England Biolabs公司；DNA 探針PNKTb（序列為5′- CCTAACCCTTTTTAGGGTTAGGGT TAGGGTTAGGG -3′）合成純化于Sangon Biological Engineering Technology & Services公司，DNA探針用 Tris-EDTA 緩沖液配備成溶液后置于-20 ℃下保存，待用；TbCl3、ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）均采購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；MgCl2采購(gòu)自Sinopharm Chemical Reagent公司；實(shí)驗(yàn)所用緩沖液均是Tris-HCl緩沖液（70 mmol/L，pH 8.0）；實(shí)驗(yàn)所使用的超純水是通過(guò)18.25 MΩ·cm-1的Milli-Q凈水系統(tǒng)所獲得。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

熒光分光光度計(jì)，F(xiàn)-2700型，日本高新技術(shù)公司；漩渦振蕩器，MX-E型，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；恒溫水浴鍋，CH1015型，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；微量進(jìn)樣器，瑞士Hamilton公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

圖1闡述了基于 DNA 熒光探針的T4 PNK活性檢測(cè)的基本反應(yīng)原理。首先，本課題組設(shè)計(jì)了可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA探針PNK-Tb，在發(fā)卡探針3’末端具有一段富含G-的堿基序列（圖中的藍(lán)色結(jié)構(gòu)）。正常情況下，PNK-Tb探針通過(guò)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，使探針3’末端富含G的堿基序列大部分被封閉在發(fā)卡結(jié)構(gòu)的莖部雙鏈中，因此導(dǎo)致與Tb3+結(jié)合形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)減少，最終只能檢測(cè)到微弱的熒光信號(hào)。當(dāng)加入T4 PNK之后，T4 PNK可在ATP提供磷酸基團(tuán)的情況下，在PNK-Tb探針形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)5’-羥基末端加上磷酸基團(tuán)，轉(zhuǎn)變成5’磷酸化末端，然后在工具酶λexo（一種能夠特異性水解5’磷酸化雙鏈末端的核酸外切酶）的作用下，將發(fā)卡結(jié)構(gòu)5’磷酸化末端水解，從而使發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，釋放出其3’末端富含G的堿基序列，通過(guò)與Tb3+結(jié)合使熒光信號(hào)提升[22-23]。對(duì)比加入T4 PNK前后的熒光變化，可以對(duì)T4 PNK活性進(jìn)行定量檢測(cè)分析。

圖1 實(shí)驗(yàn)原理圖Fig.1 Schematic illustration for T4 PNK activity detection

彩圖

1.3.2 熒光測(cè)定與其信號(hào)處理

實(shí)驗(yàn)選用的熒光染料Tb3+的激發(fā)波長(zhǎng)為260 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為545 nm。發(fā)射波長(zhǎng)區(qū)間設(shè)置為460～560 nm，激發(fā)狹縫為5.0 nm，發(fā)射狹縫為10.0 nm，測(cè)量電壓為700 V。測(cè)量時(shí)，應(yīng)極其注意玻璃皿的清潔程度。測(cè)量體系應(yīng)為100 μL。多次測(cè)量，直至觀測(cè)到熒光值穩(wěn)定后，取該值作為本輪測(cè)量的最終數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)（n≥3）。

1.3.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

為了獲得實(shí)驗(yàn)最佳的靈敏度、節(jié)約試劑用量，本課題組對(duì)Mg2+濃度、ATP 濃度、λexo濃度、Tb3+濃度多個(gè)核心反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1）Mg2+濃度優(yōu)化

首先，在100 μL Tris-HCl緩沖液（70 mmol/L，pH 8.0）中加入200 nmol/L PNK-Tb 探針和不同濃度的Mg2+（1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0 mmol/L），在 37 ℃水浴反應(yīng)5 min；然后，將20 U/mL T4 PNK、1 mmol/L ATP以及8 Uλexo加入上述反應(yīng)體系中并繼續(xù)在37℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入150 μmol/L熒光染料 Tb3+，常溫下避光反應(yīng)15 min；隨后進(jìn)行熒光測(cè)定。

2）ATP濃度優(yōu)化

首先，在100 μL Tris-HCl緩沖液（70 mmol/L，pH 8.0）中加入200 nmol/L PNK-Tb 探針和最佳濃度的 Mg2+，在37 ℃水浴反應(yīng)5 min；然后，分別將20 U/mL T4 PNK、不同濃度的ATP（0.2, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0 mmol/L）以及8 Uλexo加入上述反應(yīng)體系中并繼續(xù)在37 ℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入150 μmol/L 熒光染料Tb3+，常溫下避光反應(yīng)15 min；隨后進(jìn)行熒光測(cè)定。

3）λexo 濃度優(yōu)化

首先，在100 μL Tris-HCl緩沖液（70 mmol/L，pH 8.0）中加入200 nmol/L PNK-Tb 探針和最佳濃度的Mg2+，在37 ℃水浴反應(yīng)5 min；然后，分別將20 U/mL T4 PNK、最佳濃度的ATP以及不同濃度的λexo（1.0, 5.0, 8.0, 12.0, 16.0 U）加入上述反應(yīng)體系中并繼續(xù)在37 ℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入150 μmol/L 熒光染料Tb3+，常溫下避光反應(yīng)15 min；隨后進(jìn)行熒光測(cè)定。

4）Tb3+濃度優(yōu)化

首先，在100 μL Tris-HCl緩沖液（70 mmol/L，pH 8.0）中加入200 nmol/L PNK-Tb 探針和最佳濃度的Mg2+，在37 ℃水浴反應(yīng)5 min；然后，分別將20 U/mL T4 PNK、最佳濃度的ATP以及最佳濃度的λexo加入上述反應(yīng)體系中并繼續(xù)在37 ℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入不同濃度的熒光染料Tb3+（20.0,50.0, 100.0, 200.0, 300.0 μmol/L），常溫下避光反應(yīng)15 min；隨后進(jìn)行熒光測(cè)定。

1.3.4 T4 PNK活性分析

本文根據(jù)所測(cè)定的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)T4 PNK進(jìn)行定量分析。在100 μL反應(yīng)緩沖液中加入200 nmol/L PNK-Tb探針和最佳濃度Mg2+，在37 ℃水浴反應(yīng)5 min后加入一系列的T4 PNK（0～100 U/mL）；然后，將最佳濃度的ATP、T4 PNK以及λexo加入上述反應(yīng)體系中，繼續(xù)在37 ℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入最佳濃度的熒光染料Tb3+，常溫下避光反應(yīng)15 min后進(jìn)行熒光測(cè)定。

1.3.5 T4 PNK抑制劑分析

以ADP作為T4 PNK 活性的抑制劑。在100 μL反應(yīng)緩沖液中加入200 nmol/L PNK-Tb探針和10 mmol/L Mg2+，置于37 ℃水浴反應(yīng)5 min后加入50 U/mL T4 PNK；然后，將最佳濃度的ATP、T4 PNK以及λexo加入上述反應(yīng)體系中，并加入一定量的ADP，繼續(xù)置于37 ℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入最佳濃度的熒光染料Tb3+，置于常溫下避光反應(yīng)15 min后進(jìn)行熒光測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果

為了獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本課題組對(duì)可能影響檢測(cè)性能的條件進(jìn)行了優(yōu)化。其中，Mg2+濃度對(duì)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要作用。ATP為T4 PNK磷酸化反應(yīng)提供磷酸基團(tuán)。λexo可以特異性切割DNA雙鏈磷酸化末端，從而釋放富含G的堿基序列，因此其濃度的變化對(duì)切割效率有重要的影響。Tb3+可以與G-四鏈體結(jié)合產(chǎn)生顯著的熒光信號(hào)，其濃度的變化直接影響熒光強(qiáng)度?；谏鲜鲆蛩?，在下文中對(duì)Mg2+、ATP、λexo及Tb3+濃度分別進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1.1 Mg2+濃度優(yōu)化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制圖2。

圖2 反應(yīng)放大比隨Mg2+濃度變化的曲線圖Fig.2 The effect of the concentration of Mg2+

圖2中，F(xiàn)0為不加T4 PNK的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入T4 PNK后的熒光強(qiáng)度。由圖可知，隨著Mg2+濃度的增強(qiáng)，反應(yīng)效果不斷增大，當(dāng)濃度為10 mmol/L時(shí)達(dá)到峰值，繼續(xù)增加Mg2+濃度，反應(yīng)的放大效果反而降低。因此，10 mmol/L是Mg2+的最佳濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 ATP濃度優(yōu)化

ATP在本實(shí)驗(yàn)中主要是提供PO43-。ATP濃度優(yōu)化結(jié)果如圖3所示。由圖可知，隨著ATP濃度增加，反應(yīng)效果逐漸提高，并在ATP濃度為1 mmol/L處達(dá)到最大值，然后隨著ATP濃度的增加，反而會(huì)抑制反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致反應(yīng)的放大比例降低。因此，選擇濃度為1 mmol/L的ATP用于之后的反應(yīng)。

圖3 反應(yīng)放大比隨ATP濃度變化的曲線圖Fig.3 The effect of the concentration of ATP

2.1.3 λ exo濃度優(yōu)化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制圖4。

圖4 反應(yīng)放大比隨λ exo濃度變化的曲線圖Fig.4 The effect of the concentration of λ exo

由圖4可知，隨著λexo濃度的提高，其切除DNA雙鏈磷酸化末端的作用逐漸增強(qiáng)，在λexo活性達(dá)到8 U時(shí)，反應(yīng)的熒光放大比例達(dá)到最大值；但再繼續(xù)提高λexo濃度，反應(yīng)的放大比例反而有所減小，說(shuō)明高濃度的λexo對(duì)該反應(yīng)有一定的抑制效果。因此，將8U的λexo加入反應(yīng)體系，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 Tb3+濃度優(yōu)化

Tb3+主要是用來(lái)與反應(yīng)生成的G-rich序列形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生熒光。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制圖5。由圖可知，隨著Tb3+濃度的增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度的放大比例不斷增大，當(dāng)濃度為200 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加Tb3+濃度，反應(yīng)的放大效果反而降低。因此，將濃度為200 μmol/L的Tb3+用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 反應(yīng)放大比隨Tb3+濃度變化的曲線圖Fig.5 The effect of the concentration of Tb3+

2.2 T4 PNK的活性分析及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取得最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件后，本課題組對(duì)不同濃度T4 PNK（0, 2, 4, 6, 8, 10, 50, 100 U/mL）活性進(jìn)行了分析。T4 PNK的考察區(qū)間為0～10 U/mL。圖6是不同的DNA聚合酶濃度與反應(yīng)熒光放大倍數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖6 T4 PNK濃度與熒光放大倍數(shù)的關(guān)系曲線Fig.6 The relationship of fluorescence magnification to concentration of T4 PNK

由圖6可知，當(dāng)T4 PNK的濃度為0～10 U/mL 時(shí)，兩者呈線性關(guān)系，其線性方程式為

Y=109.158 34+11.790 46X，R2=0.997 8。

另外，本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)下限為2.0 U/mL。

圖7是不同濃度T4 PNK酶的熒光光譜圖。由圖可知，隨著T4 PNK濃度的增加，同一時(shí)間內(nèi)熒光強(qiáng)度增加的量也逐漸增加。因此，通過(guò)使用廉價(jià)又簡(jiǎn)單的熒光染料，本課題組成功地構(gòu)建了一種低成本和高靈敏的DNA聚合酶活性實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法。

圖7 不同T4 PNK濃度下的熒光光譜圖Fig.7 Fluorescence intensity of different concentrations of T4 PNK

2.3 T4 PNK特異性分析

為了進(jìn)一步評(píng)估本文分析方法的特異性，本實(shí)驗(yàn)選取了4種酶UDG、BSA、EcoRⅠ和ExoⅠ用作特異性實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果如圖8所示。

圖8 特異性分析Fig.8 Selectivity study

由圖8可知，含有UDG、BSA、EcoRⅠ和ExoⅠ的實(shí)驗(yàn)樣品與空白組相比，熒光值沒有明顯變化，這說(shuō)明4種酶在整個(gè)反應(yīng)體系沒有發(fā)揮作用，并不能導(dǎo)致上述反應(yīng)的發(fā)生，而加入T4 PNK的實(shí)驗(yàn)樣品中熒光強(qiáng)度的變化非常明顯。可見，本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)T4 PNK具有良好的選擇特異性。

2.4 T4 PNK 抑制劑的篩選

在藥物篩選上T4 PNK抑制劑分析有著重要意義。ADP是一種常見的T4 PNK抑制劑。本實(shí)驗(yàn)之所以選擇ADP作為模式抑制劑，是因?yàn)榇罅垦芯勘砻?0 mmol/L以下的ADP對(duì)λexo的活性沒有影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制圖9，其中橫坐標(biāo)代表實(shí)驗(yàn)所加ADP的濃度，縱坐標(biāo)代表相對(duì)活性。由圖可知，相對(duì)活性隨ADP濃度升高而下降，說(shuō)明抑制效果隨ADP濃度升高而增大，當(dāng)ADP濃度為4 mmol/L時(shí)，抑制率可達(dá)到90 %以上，說(shuō)明ADP作為T4 PNK的抑制劑，具有良好的抑制效果。因此，本文方法能應(yīng)用于T4 PNK抑制劑的篩選，且在小分子藥物篩選甚至生物化學(xué)機(jī)理研究中皆具有應(yīng)用前景，可以為以后生產(chǎn)抑制T4 PNK活性的藥物打下基礎(chǔ)。

圖9 ADP對(duì)T4 PNK活性的影響Fig.9 The effect of ADP on T4 PNK activity

3 結(jié)語(yǔ)

T4 PNK是DNA 復(fù)制和損傷修復(fù)中的重要角色。T4 PNK活性異常與許多疾病有關(guān)，因此開發(fā)出一種快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏、操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)方式對(duì)T4 PNK活性進(jìn)行檢測(cè)并且篩選其抑制劑，對(duì)臨床診斷研究以及現(xiàn)代醫(yī)藥研究具有重大意義。因此，本課題組基于免淬滅標(biāo)記熒光探針對(duì)T4 PNK的活性進(jìn)行了熒光檢測(cè)以及抑制劑分析，創(chuàng)新性地將稀土元素Tb3+應(yīng)用到 T4 PNK活性的檢測(cè)中，構(gòu)建并驗(yàn)證了一種快速地檢測(cè)T4 PNK新方法，探究了該實(shí)驗(yàn)方法的最佳實(shí)驗(yàn)條件，同時(shí)為該實(shí)驗(yàn)找了合適的抑制劑ADP，使得反應(yīng)可控、高效進(jìn)行。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本課題組繪制了一定濃度范圍內(nèi)的T4 PNK標(biāo)準(zhǔn)曲線，以實(shí)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)快速測(cè)定T4 PNK濃度，為T4 PNK的后續(xù)研究提供一些思考。

本文檢測(cè)方法的反應(yīng)時(shí)間較短（不超過(guò)60 min），所需的試劑價(jià)格低廉，在很大程度上降低了實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成本。因此，該方法在生物藥物開發(fā)以及生物化學(xué)研究中具有良好的應(yīng)用前景。