王超超，姜 益，趙潤英

(溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎內(nèi)科·浙江 溫州 325000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)生率及死亡率逐年升高，嚴(yán)重影響患者的生命健康[1-2]。腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells, GMCs)增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、基底膜增厚并導(dǎo)致腎小球硬化是DN發(fā)病的主要病理過程，探究GMCs增殖和凋亡機(jī)理，是預(yù)防和治療DN的關(guān)鍵[3-4]。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)/沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)/過氧化物酶增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxidase proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α)信號通路參與機(jī)體氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等生理過程，近來研究發(fā)現(xiàn)此通路也參與DN的發(fā)生發(fā)展過程[5-7]。木犀草素(Luteolin)是從木犀草的莖葉中提取的黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤及心血管保護(hù)等多種生物學(xué)效應(yīng)，大量文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)Luteolin對DN腎損傷具有保護(hù)作用[8-9]，但Luteolin保護(hù)DN腎損傷的具體分子生物學(xué)機(jī)制還不明確。本研究通過體外培養(yǎng)小鼠GMCs，探討高糖誘導(dǎo)條件下，Luteolin含藥血清對GMCs凋亡及AMPK/SIRT-1/PGC-1α通路的影響，以期為臨床治療DN提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株 健康雄性SPF清潔級SD大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量 200～220 g，購自于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SCXK(粵)2018-0002。飼養(yǎng)于本院動(dòng)物飼養(yǎng)中心，本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)同意，批號為IACUC-01(20160917)。SV40 MES13型小鼠GMCs：上?？道噬锟萍加邢薰荆浱枺篕L0194。

1.2 藥物 木犀草素(Luteolin)：山東臨沂艾澤拉斯生物科技有限公司，規(guī)格：20 mg；羅格列酮鈉片：太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，規(guī)格: 4mg/片，批號: 15090049。Luteolin及羅格列酮以生理鹽水配置為5.00、10.00、20.00 g/L及0.036 g/L的混懸液，

1.3 主要試劑及儀器 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)：購自美國Sigma(貨號：M2128)；HE染色試劑盒：上海生物公司；Trizol試劑盒：北京麥瑞博；AMPK抗體、pAMPK抗體、SIRT-1抗體、PGC-1α及凋亡相關(guān)蛋白脂肪酸合酶(Fas)抗體)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)抗體：美國abcam公司；DMEM高糖培養(yǎng)基：美國Hyclone公司；BCA蛋白定量試劑盒、胰蛋白酶：美國Pierce公司。Ver1012全自動(dòng)酶標(biāo)檢測儀：美國Versamax公司；1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀：美國Bio-Rad公司。B5-R3-v3型流式細(xì)胞儀：美國貝克曼庫爾特公司。

2 方法

2.1 含藥血清制備 大鼠50只，隨機(jī)分為正常組,Luteolin低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量組，陽性組(羅格列酮[10]，0.36 mg/kg)，每組10只；各組大鼠均以10 mL/kg的劑量灌胃給藥，正常組給予等量生理鹽水，各組連續(xù)給藥7 d，1次/d。末次給藥禁食不禁水12 h后，麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血6 mL，靜置2 h后，在4 ℃條件下3 000 r/min離心20 min, 取血清裝于5 mL青霉素小瓶中，56 ℃滅活、濾過除菌后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 GMCs復(fù)蘇與培養(yǎng) 將SV40 MES13型GMCs復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于條件為 37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，使細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上后，進(jìn)行常規(guī)傳代、計(jì)數(shù)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及培養(yǎng) 取GMCs細(xì)胞，以每孔2×105密度接種于6孔板上，適應(yīng)性培養(yǎng)24 h后，按以下分組并加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)。正常組(10%正常組血清)、高糖模型組(30 moL/L葡萄糖+10%正常組血清)、Luteolin含藥血清低(30 moL/L葡萄糖+10%低劑量組含藥血清)、中(30 moL/L葡萄糖+10%中劑量組含藥血清)、高(30 moL/L葡萄糖+10%高劑量組含藥血清)劑量組、陽性含藥血清組(30 moL/L葡萄糖+10%羅格列酮組含藥血清)；每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，以備后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 觀察指標(biāo)及測定

2.4.1 MTT法測定GMCs存活率 取對數(shù)期細(xì)胞，按2.3項(xiàng)下各組細(xì)胞分組并處理，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，向每個(gè)孔中加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，37 ℃下孵育1 h后，加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液孵育20 min后，使用自動(dòng)多孔分光光度計(jì)測量490 nm的光密度(OD)值。存活率%=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白組OD值×100%。

2.4.2 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài) 取2.3項(xiàng)下各組細(xì)胞，用40 g/L多聚甲醛固定10 min后，HE染色，并置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.4.3 流式細(xì)胞儀檢測GMCs凋亡率 取2.3項(xiàng)下生長24、48 h的各組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.4.4 Western Blot檢測AMPK、pAMPK、SIRT-1、PGC-1α及凋亡相關(guān)蛋白Fas、Bcl-2蛋白表達(dá) 取2.3項(xiàng)下各組細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液，離心分離后，取上清液提取蛋白，按BCA 試劑盒說明書檢測蛋白濃度，取200 μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜后，置于5%的脫脂奶粉溶液中，37 ℃封閉2 h，加入抗體(AMPK、pAMPK、SIRT-1、PGC-1α，F(xiàn)as、Bcl-2、β-actin(內(nèi)參)，1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000，1∶2 000)并于4 ℃冰箱中孵育過夜，TBST漂洗3次后，加入1∶1 000的羊抗兔二抗溶液，室溫孵育2 h，經(jīng)TBST再次漂洗3次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 Luteolin含藥血清對GMCs存活的影響 見表1。

表1 各組GMCs存活率檢測結(jié)果

3.2 Luteolin含藥血清對GMCs形態(tài)學(xué)的影響 正常組細(xì)胞核形態(tài)正常；與正常組相比，模型組細(xì)胞密度增高，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量微絲樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核周圍有大量小顆粒沉積；與模型組組相比，Luteolin低、中、高劑量組細(xì)胞密度、胞漿微絲樣結(jié)構(gòu)及核周圍小顆粒沉積均有不同程度減弱，且Luteolin各劑量組上述現(xiàn)象呈劑量依賴性降低。陽性組細(xì)胞變化與Luteolin高劑量組相似。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞HE 染色形態(tài)學(xué)觀察

3.3 Luteolin含藥血清對GMCs凋亡的影響 見表2。

表2 各組GMCs凋亡率檢測結(jié)果

3.4 Luteolin含藥血清對GMCs凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Fas相對表達(dá)水平的影響 見圖1，表3。

表3 各組GMCs Bcl-2、Fas蛋白表達(dá)水平

3.5 Luteolin含藥血清對GMCs凋亡相關(guān)蛋白pAMPK/AMPK、SIRT-1、PGC-1α相對表達(dá)水平的影響 見圖1，表4。

表4 各組細(xì)胞pAMPK/AMPK、SIRT-1、PGC-1α蛋白表達(dá)水平

A.正常組；B.模型組；C.Luteolin低劑量組；D.Luteolin中劑量組；E.Luteolin高劑量組；F.陽性對照組

A.正常組；B.模型組；C.Luteolin低劑量組；D.Luteolin中劑量組；E.Luteolin高劑量組；F.陽性對照組

4 討論

近年來，隨著社會的發(fā)展、人民生活水平的提高，糖尿病患病率也隨之升高，并成為繼心血管病、腫瘤之后的第三大非傳染性疾病，而DN是威脅糖尿病患者生命的主要原因[10-11]。GMCs異常增生、肥大等病變是DN發(fā)展的主要病理過程，而高濃度葡萄糖可促進(jìn)GMCs增生、肥大及胞外基質(zhì)產(chǎn)生和積聚，并導(dǎo)致腎損傷[3,10]。體外培養(yǎng)并用高濃度葡萄糖誘導(dǎo)GMCs可模擬DN病理過程[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組GMCs細(xì)胞密度增高、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微絲樣結(jié)構(gòu)增多、細(xì)胞核可見小顆粒沉積等病變，而GMCs存活率升高、凋亡率下降；提示高糖誘導(dǎo)下，GMCs增生嚴(yán)重，凋亡減弱。

文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)Luteolin對腎臟損傷具有較好的改善作用，汪海洋[13]等發(fā)現(xiàn)Luteolin可降低單側(cè)輸尿管梗塞性大鼠腎臟炎性和纖維化損傷；譚斅[14]等發(fā)現(xiàn)Luteolin可降低汞中毒小鼠腎臟損傷；裘兒杰[9]等發(fā)現(xiàn)Luteolin可減輕試驗(yàn)性DN大鼠腎臟損傷；然而Luteolin保護(hù)腎損傷的具體分子機(jī)制還不明確。本研究體外培養(yǎng)并用高濃度葡萄糖誘導(dǎo)GMCs，探究Luteolin含藥血清對GMCs增殖及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，Luteolin含藥血清低、中、高劑量組及陽性對照組GMCs細(xì)胞密度降低、胞質(zhì)微絲結(jié)構(gòu)及胞核顆粒沉積等減輕，GMCs存活率降低、凋亡率升高；表明Luteolin含藥血清可抑制高糖誘導(dǎo)的GMCs增殖，促進(jìn)其凋亡。

SIRT1可調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，參與細(xì)胞衰老、凋亡、DNA修復(fù)等生理過程[15]。AMPK和SIRT1是細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，可調(diào)節(jié)PGC-1α的活性，參與機(jī)體能量代謝、線粒體功能、細(xì)胞凋亡等過程[5-6,16]。大量文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，AMPK/SIRT-1/PGC-1α通路參與腎小球病變過程。張笑栩[17]等發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞免疫炎性損傷的分子機(jī)制可能與AMPK通路活化有關(guān)；Shat[18]等發(fā)現(xiàn)AMPK磷酸化水平降低，可抑制SIRT1活性水平，促進(jìn)腎小球炎癥反應(yīng)和增生；Liao[19]等發(fā)現(xiàn)SIRT1活性水平降低的同時(shí)，也可引起PGC-1α水平的降低，并促進(jìn)線粒體代謝障礙的發(fā)生，而加重腎小球病變。但AMPK/SIRT-1/PGC-1α通路在體外培養(yǎng)并用高濃度葡萄糖誘導(dǎo)GMCs中的作用，還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組GMCs中pAMPK/AMPK、SIRT-1、PGC-1α蛋白表達(dá)均降低。另外凋亡相關(guān)蛋白Fas、Bcl-2亦參與高糖誘導(dǎo)的GMCs凋亡過程，齊月亮[20]等研究顯示下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Fas基因表達(dá)，可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)增生的GMCs凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組GMCs中凋亡相關(guān)蛋白Fas表達(dá)下降、Bcl-2表達(dá)升高，提示高糖誘導(dǎo)下，GMCs細(xì)胞中pAMPK/AMPK、SIRT-1、PGC-1α蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡減弱；而用Luteolin含藥血清培養(yǎng)GMCs細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，Luteolin含藥血清低、中、高劑量組及陽性對照組pAMPK/AMPK、SIRT-1、PGC-1α蛋白表達(dá)升高，凋亡相關(guān)蛋白Fas表達(dá)升高、Bcl-2表達(dá)下降；表明Luteolin含藥血清可能通過激活A(yù)MPK/SIRT-1/PGC-1α蛋白表達(dá)，促進(jìn)高糖條件下GMCs凋亡。

綜上所述，Luteolin含藥血清可能通過激活A(yù)MPK/SIRT-1/PGC-1α蛋白表達(dá)，抑制高糖誘導(dǎo)下GMCs過度增生，促進(jìn)其凋亡。為臨床Luteolin治療DN提供一定的理論依據(jù)。