張麗虹 王 鋒 趙小貞 王 瑋

（福建醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)系，臨床應(yīng)用解剖學(xué)研究室，腦老化與神經(jīng)變性疾病福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350122）

MicroRNA 是真核生物體內(nèi)一種內(nèi)源性小分子單鏈RNA，通過(guò)與目標(biāo)mRNA的3'UTR區(qū)不完全互補(bǔ)結(jié)合形成沉默復(fù)合物，抑制靶基因表達(dá)。睪丸內(nèi)緊密連接位于生精小管基底部的支持細(xì)胞之間，是血-睪屏障（blood-testis barrier，BTB）最主要的組成部分，主要由3種跨膜蛋白（occludin、claudin、JAM）和外周胞質(zhì)蛋白（zonula occluden，ZO）構(gòu)成，最終錨定于細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白（actin）骨架系統(tǒng)[1]。研究顯示，能夠引起肌動(dòng)蛋白骨架系統(tǒng)紊亂的因素同樣會(huì)造成緊密連接損傷[2-4]，例如PI3K/Akt信號(hào)通路的激活[5-13]及肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3（actin-related-proteins 2/3，Arp2/3）非正常地活化及轉(zhuǎn)移等[14]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種非受體型酪氨酸激酶，可與緊密連接處的occludin 或ZO-1 等蛋白復(fù)合物結(jié)合[6，15]，并通過(guò)轉(zhuǎn)變其不同位點(diǎn)的磷酸化形式參與緊密連接調(diào)控[16-19]，影響分枝狀肌動(dòng)蛋白骨架系統(tǒng)的成核及聚合過(guò)程[20-22]。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homology deleted from chromosometen，PTEN）是一種具有雙重特異磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼的蛋白既可以作為脂質(zhì)磷酸酶抑制PI3K/Akt信號(hào)通路激活，又可以作為蛋白磷酸酶使FAK的第397位酪氨酸發(fā)生去磷酸化，降低p-FAK-Tyr397水平[23]。本研究主要探討miR-181d-5p 是否可以與PTEN mRNA的3'UTR區(qū)相互作用，并降低其表達(dá)，通過(guò)升高p-FAK-Tyr397水平以及激活PI3K/Akt信號(hào)通路影響肌動(dòng)蛋白骨架系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，造成緊密連接損傷。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMEN/F-12、PBS（HyClone公司）；胎牛血清（BI公司）；PTEN、FAK、p-FAK-Tyr397、Akt、p-Akt-Thr308、β-actin兔抗鼠多克隆抗體（Cell Signaling公司）；Lipofectamine 2000試 劑（Invitrogen公司）；Opti-MEMⅠ、0.25%Trypsin-EDTA、DMSO、Penicillin-Streptomycin（Gibco公司）；Dual-Luciferase Report Assay試劑盒（Promega公司）。

1.2 雙熒光素酶報(bào)告基因分析實(shí)驗(yàn)

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒購(gòu)買于吉?jiǎng)P基因公司，分別為miR-181d-5p NC空白對(duì)照質(zhì)粒、miR-181d-5p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、重組PTEN mRNA 3'UTR野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（PTEN-3'UTR-wt）、重組PTEN mRNA 3'UTR 突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（PTEN-3'UTR-mut）、內(nèi)參海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 293T細(xì)胞采用常規(guī)細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，條件為37℃、5%CO2及飽和濕度。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為PTEN-3'UTR-wt+miR-181d-5p NC組、PTEN-3'UTR-wt+miR-181d-5p組、PTEN-3'UTRmut+miR-181d-5p NC組、PTEN-3'UTR-mut+ miR-181d-5p組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行熒光檢測(cè)，具體操作過(guò)程按照雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

同時(shí)在293T細(xì)胞上采用質(zhì)粒單純過(guò)表達(dá)miR-181d-5p，設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為293T+miR-181d-5p NC空白對(duì)照組（293T+miR NC組）和293T+miR-181d-5p過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組（293T+miR組），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.3 TM4細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-181d-5p及細(xì)胞間跨膜電阻（transepithelial electrical resistance，TER）值測(cè)定

1.3.1 MicroRNA mimic構(gòu)建由于TM4細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率不高，因此miR-181d-5p過(guò)表達(dá)采用microRNA mimic（吉瑪基因生物公司）進(jìn)行，分別設(shè)為miR-181d-5p NC空白對(duì)照mimic 和miR-181d-5p過(guò)表達(dá)mimic。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4細(xì)胞購(gòu)買于ATCC公司，采用常規(guī)細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，條件為37℃、5%CO2及飽和濕度，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為TM4+miR-181d-5p NC空白對(duì)照組（TM4+miR NC組）和TM4+miR-181d-5p過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組（TM4+miR組），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組mimic轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行相關(guān)信號(hào)分子和TER值測(cè)定。

1.3.3 TER值測(cè)定 使用Millicell ERS 電阻儀測(cè)定TM4細(xì)胞間TER值，在24孔板中放入插入小室測(cè)定，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，具體操作過(guò)程參照儀器使用說(shuō)明書(shū)，測(cè)定的單位面積電阻值的計(jì)算方法為：?jiǎn)挝幻娣e電阻值（Ωcm2）=電阻值（Ω）×有效跨膜面積（cm2）（24孔板的有效跨膜面積值為0.6 cm2）。

1.4 免疫印跡檢測(cè)

24孔板轉(zhuǎn)染后48 h，采用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。制備SDS 聚丙烯酰胺凝膠，并進(jìn)行電泳分離，每孔上樣量為20 μL，總蛋白上樣量約為40 μg。轉(zhuǎn)膜及脫脂奶粉封閉1 h后，采用一抗4℃孵育過(guò)夜（PTEN、FAK、p-FAK-Tyr397、β-actin稀釋倍數(shù)為1：500，Akt和p-Akt-Thr308為1∶200），HRP標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，分子生物學(xué)發(fā)光儀拍攝，Image J 軟件計(jì)算條帶灰度值，并計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，采用單因素ANOVA 分析及Tukey 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-181d-5p可以與PTEN mRNA 3'UTR區(qū)結(jié)合，并降低其表達(dá)

雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的效率為60%～70%（圖1A～D）。PTEN-3'UTR-wt+miR-181d-5p組的相對(duì)熒光值比率低于其他組（P＜0.05）（圖1E、F），證明miR-181d-5p可以與PTEN mRNA 3'UTR區(qū)結(jié)合。免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，293T細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-181d-5p后（圖2A、B），PTEN蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）（圖2C）。

圖1 雙熒光素酶報(bào)告基因分析各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，標(biāo)尺=100 μm

圖 2 各組在293T細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-181d-5p 效率及PTEN蛋白表達(dá)，標(biāo)尺=100 μm

2.2 TM4細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-181d-5p 引起TER值降低

結(jié)果顯示，microRNA mimic 轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞的效率為30%～35%（圖3A、B）。TM4細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-181d-5p后PTEN蛋白水平降低，p-Akt-Thr308和p-FAK-Tyr397水平升高（P＜0.05）（圖3C、D），但Akt 及FAK表達(dá)水平?jīng)]有變化。TM4細(xì)胞間相對(duì)TER值（0.70±0.15）降低。

圖3 各組小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-181d-5p 效率及各蛋白表達(dá)，標(biāo)尺=100 μm

3 討論

3.1 MiR181d-5p通過(guò)與PTEN mRNA 3'UTR結(jié)合降低PTEN蛋白表達(dá)

近年來(lái)研究顯示，microRNA 無(wú)論是在生理還是病理?xiàng)l件下均發(fā)揮重要作用，不僅參與眾多生物學(xué)過(guò)程，同時(shí)與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[24-25]。MicroRNA可通過(guò)與mRNA的3'UTR區(qū)不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)一步誘導(dǎo)mRNA的降解、切割及翻譯抑制等過(guò)程，抑制靶基因的表達(dá)。本研究主要基于前期精索靜脈曲張動(dòng)物模型的研究結(jié)果開(kāi)展，通過(guò)對(duì)睪丸組織進(jìn)行microRNA測(cè)序、篩選及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，顯示精索靜脈曲張會(huì)引起左側(cè)睪丸組織內(nèi)miR-181d-5p表達(dá)升高以及緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的的損傷[26]。通過(guò)查閱相關(guān)網(wǎng)站（http：//www.targetscan.org/vert_71/）發(fā)現(xiàn)，PTEN mRNA的3'UTR區(qū)存在3個(gè)潛在可以與miR-181d-5p結(jié)合的位點(diǎn)（核苷酸序列為TGAATGT，分別為2261～2267位、2468～2474位和2675～2681位）。通過(guò)生物信息學(xué)分析，推測(cè)精索靜脈曲張引起的miR-181d-5p表達(dá)水平升高，可能參與了睪丸內(nèi)緊密連接損傷過(guò)程，并可能是通過(guò)降低PTEN的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，但具體機(jī)制尚未明確。因此，設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)的目的是驗(yàn)證miR-181d-5p 是否可以與PTEN mRNA的3'UTR區(qū)結(jié)合，并降低其表達(dá)，通過(guò)PTEN 參與睪丸支持細(xì)胞間緊密連接的損傷過(guò)程，試圖從microRNA層面闡述緊密連接動(dòng)力學(xué)調(diào)控及損傷機(jī)制。本研究結(jié)果證實(shí)miR-181d-5p可以與PTEN mRNA的3'UTR區(qū)結(jié)合，且293T細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-181d-5p后可引起PTEN蛋白表達(dá)降低。

3.2 PTEN 水平降低造成睪丸支持細(xì)胞間緊密連接損傷的機(jī)制

PTEN 是一種具有雙重特異磷酸酶活性的抑癌基因，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，miR-181d-5p通過(guò)降低PTEN表達(dá)參與緊密連接損傷的機(jī)制可能主要涉及以下兩個(gè)方面。

首先，PTEN作為脂質(zhì)磷酸酶可以抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，它可使該信號(hào)通路的第二信使phosphatidylinositol（3，4，5）-trisphosphate（PIP3）發(fā)生去磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)閜hosphatidylinositol（4，5）-bisphosphate（PIP2），從而抑制下游信號(hào)分子激活。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可通過(guò)擾亂肌動(dòng)蛋白骨架系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)造成緊密連接損傷，而給予PI3K/Akt信號(hào)通路阻斷劑，能夠減輕由生殖毒性物質(zhì)或其他理化因素造成的緊密連接損傷[5-13]?；诒緦?shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)由miR-181d-5p過(guò)表達(dá)引起的PTEN表達(dá)水平降低，進(jìn)一步激活PI3K/Akt信號(hào)通路，參與緊密連接損傷過(guò)程。此外，研究顯示PIP2在細(xì)胞膜上的含量需＞5%，才可啟動(dòng)正常地由WASP（Wiskott-Aldrich syndrome protein）家族蛋白和Arp2/3 介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白成核和聚合過(guò)程[27]；PIP3可通過(guò)激活Rho 小GTPase家族蛋白調(diào)控肌動(dòng)蛋白骨架系統(tǒng)[28]。因此，推測(cè)PTEN 還可能通過(guò)改變PIP2和PIP3的濃度及定位，參與緊密連接損傷，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

其次，PTEN作為蛋白質(zhì)磷酸酶，可以與FAK的第397位酪氨酸位點(diǎn)直接結(jié)合，并引起該位點(diǎn)去磷酸化[23]。FAK在睪丸組織內(nèi)可定位于緊密連接處，與occludin或ZO-1等復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)轉(zhuǎn)變其不同位點(diǎn)的磷酸化形式（例如p-FAK-Tyr397、p-FAK-Tyr407、p-FAK-Tyr576）[16-19]參與緊密連接調(diào)控。Arp2/3是介導(dǎo)分枝狀肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架成核和聚合的關(guān)鍵蛋白，F(xiàn)AK可以與Arp2/3結(jié)合，并增加Arp2/3的活性；而FAK 第397位酪氨酸磷酸化會(huì)消減其與Arp2/3之間的相互作用，影響Arp2/3 正常地活化及轉(zhuǎn)移過(guò)程，間接造成緊密連接損傷[20，22]。此外，p-FAK-Tyr397水平升高還能進(jìn)一步促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活[29]。因此，由PTEN表達(dá)降低引起的p-FAK-Tyr397水平增高及PI3K/Akt信號(hào)通路激活并不是兩個(gè)完全孤立的生物學(xué)過(guò)程，兩者之間密切聯(lián)系，相輔相成又相互促進(jìn)，共同參與緊密連接損傷。

綜上所述，miR-181d-5p可能通過(guò)降低PTEN表達(dá)，導(dǎo)致p-FAK-Tyr397水平升高以及激活PI3K/Akt信號(hào)通路，參與緊密連接損傷。由于本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均來(lái)自體外實(shí)驗(yàn)，存在一定局限性，而緊密連接的動(dòng)力學(xué)調(diào)控涉及非常復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，PTEN 參與緊密連接損傷的確切機(jī)制還需要更為詳盡的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。