李海云 楊東光 洪秀麗 李金波 王 輝

（涿州市醫(yī)院普外科，涿州 072750）

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因，而骨是乳腺癌最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位，有65%～75%的乳腺癌可發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[1]，其嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后生存期。因此研究乳腺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制，尋找新的治療方式在臨床治療中具有非常重要的意義。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）是在乳腺癌組織中表達最為廣泛的BMP家族成員之一，其可能參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及骨轉(zhuǎn)移進程，但具體作用機制尚不清楚。本研究以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為模型，通過改變BMP4基因的表達變化，觀察BMP4對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并對可能的機制進行初步探討。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)胰蛋白酶（0.25%Tryopsin-EDTA）、PBS緩沖液、青鏈霉素溶液購自美國HyClone公司；胎牛血清（FBS）購自美國GibcoBRL公司；Ⅰ型膠原酶購自美國Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）、TRIzol 試劑購自美國 Invitrogen公司；CCK-8 購自日本同仁化學(xué)研究所；Transwell 小室購自美國Millipore公司；BMP4 和β-actin 引物由金唯智生物技術(shù)有限公司合成；Matrigel膠購自美國BD公司；PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR Premix Ex Taq II（TliRNaseH Plus）購自日本TaKaRa公司；MCF-7和293-T細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞庫

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

采用添加有10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基，37℃、飽和濕度5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，MCF-7細(xì)胞2～3 d 換液，4～6 d傳代；293T細(xì)胞2～3 d 傳代一次。當(dāng)細(xì)胞生長融合至90%時，棄去原培養(yǎng)基，PBS 輕輕洗滌細(xì)胞1遍，加入0.25%Tryopsin-EDTA 消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓、細(xì)胞間隙増大時，棄去胰酶，加入含有10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打至單細(xì)胞懸液，MCF-7按1∶6傳代，293T按1：20傳代。將MCF-7細(xì)胞慢病毒感染后分為以下幾組：（1）空白組（Blank），慢病毒不感染MCF-7細(xì)胞；（2）慢病毒空載對照組（Lv-NC組），慢病毒空載體Lv-EGFP感染MCF-7細(xì)胞；（3）過表達實驗組（Lv-BMP4組），重組慢病毒Lv-BMP4 感染MCF-7細(xì)胞；（4）干擾實驗組（Lv-shBMP4組），重組慢病毒Lv-shBMP4 感染MCF-7細(xì)胞。

1.4 慢病毒包裝、濃縮及滴度檢測

轉(zhuǎn)染前24 h，將生長狀態(tài)良好處于對數(shù)期的293T細(xì)胞用胰酶消化制成細(xì)胞懸液，接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中；待細(xì)胞密度達到70%左右，將重組慢病毒質(zhì)粒和psPAX2、pMD2.G 經(jīng)PEI 共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，用無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4～6 h后，更換新鮮含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。48 h 收集病毒上清液，并添加新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染72 h后繼續(xù)收集病毒上清；4℃ 3 000 r/min離心15 min，離心收取的上清用0.45 μm 濾器進行過濾，4℃ 20 000r/min 超速離心2 h，1 mL 新鮮培養(yǎng)液重懸病毒沉淀，置于-80℃保存。

取對數(shù)生長期293T細(xì)胞，胰酶消化制成懸液，于96孔板加入293T細(xì)胞1×104/孔，體積100 μL，培養(yǎng)過夜；取10 μL 慢病毒原液，用含10%FBS的DMEM 完全培養(yǎng)液10倍稀釋3～5個梯度，吸棄96孔板中原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 稀釋的慢病毒液，同時設(shè)立空白對照組，37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h；吸棄稀釋病毒培養(yǎng)液，更換新鮮培養(yǎng)液，37℃5%CO2培養(yǎng)72 h。通過倒置熒光顯微鏡計數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)，并結(jié)合病毒稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。

1.5 慢病毒感染MCF-7細(xì)胞

取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)，3×105/孔接種于6孔板，添加培養(yǎng)基至每孔1.5 mL，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至60%～70%匯合度時，更換新鮮培養(yǎng)基并添加適量慢病毒感染細(xì)胞。感染第2天，吸棄含病毒的培養(yǎng)液，更換新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。感染后72 h，熒光顯微鏡下觀察感染效率。并收集感染后的細(xì)胞樣本，用于Real-time PCR 和ELISA檢測。

1.6 RT-PCR檢測

感染72 h的MCF-7用PBS洗2次，然后加入適量的TRIzol，于室溫下靜置5min，加入氯仿100 μL，靜置5min，置于4℃低溫離心機中，12 000 r/min離心15min，小心吸取上清至新的EP管（不含RNA酶）中，加入和上清等體積的異丙醇，輕微振蕩，在室溫下靜置10 min后，置于4℃低溫離心機中，12 000 g離心10 min，棄上清留沉淀，并加入預(yù)先配好的75%乙醇，洗滌白色沉淀2次，動作要輕，避免將沉淀吹散，置于4℃低溫離心機中，7 500 g離心5 min，棄掉乙醇，加入適量DEPC 水以溶解管底沉淀。測定總RNA的濃度：用核酸濃度測定儀監(jiān)測提取的RNA 濃度。RNA的濃度用OD260/280 比值來表示。

按照PrimeScriptTMRT Master Mix第一鏈cDNA合成試劑盒操作說明合成cDNA，以1 μL cDNA為模板，進行 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μL，引物（10 μmol/L）1 μL，模板（cDNA）1 μL，最后ddH2O 補足至總體積20 μL；混勻后上機。反應(yīng)條件：95℃ 10s預(yù)變性，95℃ 5s變性，60℃ 15 s退火，72℃ 15 s延伸，40個循環(huán)。引物序列：β-actin：5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'（上游），5'-CCATACCCAGGAAGGAAGGCT-3'（下游）；BMP4：5'-GGCTACCAGGCCTTCTACTG-3（'上游）；5'-CAGGCCTTAGGGATGCTAGA-3'（下游）。以β-actin為內(nèi)參計算BMP4 mRNA相對表達量。

1.7 ELISA法檢測

收集各慢病毒感染組上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書對細(xì)胞培養(yǎng)上清中BMP4的蛋白水平進行測定。使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下進行讀數(shù)并分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算分泌蛋白BMP4的濃度。

1.8 CCK-8法檢測

每組設(shè)4 各平行孔。慢病毒感染72 h后，取各感染組細(xì)胞胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，4×103/孔，每孔100 μL/鋪96孔板，設(shè)4個時間點（1、2、3、4 d），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。到相應(yīng)時間點，在鋪有MCF-7細(xì)胞的96孔板中每孔加入10 μL CCK8，輕微振蕩混勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，終止培養(yǎng)；將其放在酶標(biāo)儀上進行檢測，將波長調(diào)為450 nm，記錄各孔的吸光度（OD）值。

1.9 劃痕實驗檢測

各組慢病毒感染MCF-7細(xì)胞72 h后，胰酶消化各感染組細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，5×105/孔接種于6孔板中并補足培養(yǎng)液到每孔1.5 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用10 μL 小吸頭進行孔內(nèi)劃痕，用PBS 清洗劃下的細(xì)胞，洗3次，然后在6孔板中每孔加入2.5 mL 無血清無抗生素的培養(yǎng)液，在熒光倒置顯微鏡下對劃痕的6孔板中乳腺癌細(xì)胞拍照，沿劃痕邊緣等距離取3個視野，測量每個視野的劃痕寬度，然后取每個視野的平均值，記為0 h 劃痕寬度。之后，分別在24、48 h時取出6孔板對劃痕細(xì)胞進行拍照，并在同一觀測點計算劃痕寬度。劃痕愈合率（%）=（0 h的劃痕寬度-48 h的劃痕寬度）/0 h的劃痕寬度×100%。以此反映MCF-7細(xì)胞橫向遷移能力的變化。

1.10 Transwell 檢測

實驗分組同1.3，采用Transwell 小室進行細(xì)胞遷移實驗，將乳腺癌 MCF-7細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化及離心后計數(shù)，在Transwell 小室下室加入600 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)液作為趨化刺激物，用8 μm 孔徑的聚碳微孔膜，50 μL的Matrigel 膠（0.2 mg/mL）包被Transwell 小室上層，于上室加入400 μL 1.25×105/mL MCF-7細(xì)胞懸液。將小室置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱24 h后，取出Transwell 小室，吸去培養(yǎng)液，用PBS溶液洗2次，自然干燥，用棉簽拭去未穿膜的細(xì)胞；用4%多聚甲醛在室溫下固定20 min，風(fēng)干；用結(jié)晶紫染色20 min，水洗5～6次，風(fēng)干。在熒光顯微鏡下隨機選5個視野，觀察每個視野穿膜細(xì)胞數(shù)，并取平均值，以評價各組乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。以表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK 檢驗；檢驗水準(zhǔn)α=0.05，即以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒包裝及感染MCF-7細(xì)胞效率

熒光顯微鏡觀察顯示，進行慢病毒包裝72 h后可見綠色熒光蛋白（GFP）表達，且熒光陽性率均達90%以上，顯示慢病毒成功包裝（圖1A）。將包裝好的慢病毒顆粒梯度稀釋后感染MCF-7細(xì)胞，72 h后熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光情況。結(jié)果顯示，慢病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）值為40時，熒光顯微鏡觀察視野中90%以上的細(xì)胞均可見綠色熒光蛋白，表明此時慢病毒成功感染MCF-7細(xì)胞。因此，將MOI值40 作為感染實驗用MOI（圖1B、C、D）。

2.2 MCF-7細(xì)胞BMP4 基因 mRNA的表達

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，重組慢病毒體外轉(zhuǎn)染效率高，Lv-BMP4組BMP4表達的數(shù)值為4.50 ng/mL，與對照組Lv-NC表達數(shù)值1.00 ng/mL和空白組Blank表達數(shù)值1.00 ng/mL相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而Lv-NC對照組與空白組Blank之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；LvshBMP4組BMP4的mRNA表達數(shù)值為0.5 ng/mL，表達水平低于Lv-NC對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

（P＜0.01）。

2.3 MCF-7細(xì)胞上清中BMP4 蛋白表達水平

慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后，ELISA檢 測MCF-7細(xì)胞BMP4 蛋白水平表達的變化，結(jié)果顯示Lv-BMP4組（3.051±0.072）ng/mL 蛋白表達水平上調(diào)，與對照組Lv-NC（1.695±0.061）ng/mL相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Lv-NC對照組（1.695±0.061）ng/mL與空白組Blank（1.493±0.055）ng/mL之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Lv-BMP4 shRNA組（0.956±0.057）ng/mL BMP4的蛋白水平低于Lv-NC組（1.695±0.061）ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 BMP4對MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響

CCK8 法檢測結(jié)果顯示，慢病毒感染后第3天，Lv-BMP4組增殖能力明顯低于Lv-NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Lv-NC組與Blank組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明Lv-BMP4感染后乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖活力在第3天時受到明顯抑制；Lv-shBMP4組的增殖能力明顯高于Lv-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。第4天時，Lv-BMP4組的細(xì)胞增殖活力也顯著低于對照組（P＜0.05），說明增殖抑制作用依然明顯；Lv-shBMP4組的細(xì)胞增殖活力亦顯著高于對照組（P＜0.05）。說明在重組慢病毒感染過表達BMP4后能夠在第3天和第4天抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖活力，而將BMP4 干擾后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖活力明顯增高。

2.5 BMP4對MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕愈合實驗結(jié)果顯示（圖2），24 h時Lv-BMP4 劃痕愈合率已有低于對照組Lv-NC組的趨勢，而Lv-shBMP4組的劃痕愈合率亦有高于Lv-NC組的趨勢。在48 h，Lv-BMP4組劃痕愈合能力更加顯著，而Lv-shBMP4組的劃痕愈合能力也明顯減?。ū?）。

表1 劃痕愈合實驗檢測慢病毒感染MCF-7細(xì)胞劃痕愈合率（±s，%）

表1 劃痕愈合實驗檢測慢病毒感染MCF-7細(xì)胞劃痕愈合率（±s，%）

組別 0 h 24 h 48 h Blank 0.00 25.32±1.10 51.87±5.89 Lv-NC 0.00 26.41±1.08 52.63±6.89 Lv-BMP4 0.00 17.83±0.72 27.16±2.63 Lv-shBMP4 0.00 33.21±2.65 65.39±9.72

2.6 BMP4對MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響

利用Transwell 基質(zhì)膠體外侵襲模型觀察BMP4對MCF-7細(xì)胞侵襲的作用。結(jié)果顯示，與對照組Lv-NC 相比，Lv-BMP4組中穿過Transwell基質(zhì)膠半透膜到達下表面的細(xì)胞數(shù)量明顯降低，而Lv-NC與空白組Blank組沒有明顯區(qū)別；Lv-shBMP4組與對照組相比，MCF-7細(xì)胞穿過Transwell 小室的數(shù)目顯著升高，說明BMP4 可削弱MCF-7細(xì)胞的體外侵襲能力（圖3）。

圖1 慢病毒293T細(xì)胞包裝效率及感染MCF-7細(xì)胞后感染效率，倒置熒光顯微鏡，×200，標(biāo)尺=20 μm。A：慢病毒包裝后293T細(xì)胞，熒光視場；B：病毒上清感染MCF-7細(xì)胞，Lv-NC組；C：病毒上清感染MCF-7細(xì)胞，Lv-BMP4組；D：病毒上清感染MCF-7細(xì)胞，Lv-BMP4 shRNA組.

圖2 劃痕愈合實驗檢測慢病毒感染MCF-7細(xì)胞0 h (A1～D1)、24 h (A2～D2)、48 h (A3～D3)后對細(xì)胞遷移能力的影響，標(biāo)尺=20 μm。A：Blank組；B：Lv-NC組；C：Lv-BMP4組；D：Lv-shBMP4組.

圖3 Transwell 遷移實驗（結(jié)晶紫染色），標(biāo)尺=20 μm。A：Blank組；B：Lv-NC組；C：Lv-BMP4組；D：Lv-shBMP4組.

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，多發(fā)于40～60歲絕經(jīng)前后的婦女[1]。近年來，乳腺癌發(fā)病率以每年3%的速度增長，且發(fā)病年齡也逐漸趨于年輕化[2-3]。已成為中國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的身心健康。鑒于乳腺癌的惡性生物學(xué)特性，其最終多會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。骨轉(zhuǎn)移為乳腺癌最常見的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移部位，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中，占50%～70%[4]。發(fā)生乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的患者常出現(xiàn)頑固性骨痛、病理性骨折、高鈣血癥、功能障礙、脊髓壓迫等一系列骨相關(guān)事件（skeletal related events，SREs），嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致死亡[5]。雖然近年來對乳腺癌的治療有了顯著的進步，但乳腺癌轉(zhuǎn)移尤其是骨轉(zhuǎn)移仍然是乳腺癌治療的一大難題。目前骨轉(zhuǎn)移的分子機制尚未完全明確，因此，深入研究乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機制，進一步闡明其發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點顯得尤為重要。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中最大的亞家族，由Urist于1965年發(fā)現(xiàn)，Wozney等從骨基質(zhì)中分離出來，被鑒定出具有誘導(dǎo)軟骨形成的能力。BMPs 作為分泌型糖蛋白，在胚胎發(fā)育和器官形成過程中發(fā)揮著重要作用，同時，還通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。BMP4 是BMPs家族中的成員，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。BMP4 在不同類型的癌癥中所起的作用不盡相同，具有組織特異性。有文獻報道，BMP4 可促進肝癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲。而在促腎上腺皮質(zhì)激素瘤中則表達明顯降低，起抑癌作用[7]。BMP4 在乳腺癌組織中廣泛表達，而其在乳腺癌中的作用也不同。BMP4 可通過阻止骨髓抑制細(xì)胞（MDSC）的累積來抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[8]。而研究報道[9]當(dāng)miR-191表達量升高時，BMP4 可通過TGF-β 信號通路促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移。此外，研究發(fā)現(xiàn)[10]，BMP4 在抑制乳腺癌細(xì)胞生長的同時，在體內(nèi)外還能誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移。鑒于BMP4 在乳腺癌中作用的雙重性，對BMP4 在乳腺癌及其細(xì)胞系中進行相關(guān)研究，豐富BMP4 在乳腺癌中可能作用機制的理論依據(jù)，顯得十分必要。我們目前的實驗研究旨在探究不同表達水平的BMP4對乳腺癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響，為BMP4 在乳腺癌尤其是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的臨床研究提供新思路。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular growth factor，VEGF）作為一個強烈的促進血管發(fā)生和促進腫瘤生長的因子。在不同種類的腫瘤細(xì)胞中通過抑制腫瘤細(xì)胞分泌VEGF，均可起到抑制腫瘤生長的作用。而BMP4 介導(dǎo)的信號調(diào)節(jié)通路可通過減少VEGF的分泌，從而抑制腫瘤的生長。此外，研究顯示[11]，BMP4 還可通過Smad 信號通路，使MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G1期，加速癌細(xì)胞的凋亡，顯著抑制癌細(xì)胞的生長、增殖。同時，BMP4 還可通過激活Smad 通路和p38MAPK信號通路促使癌細(xì)胞走向過早性衰老。本實驗表明通過構(gòu)建BMP4過表達慢病毒載體，使BMP4基因在MCF-7細(xì)胞中過表達，通過與正常MCF-7細(xì)胞增殖能力的比較，證實了BMP4對乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞增殖能力的抑制作用，而將BMP4 干擾后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖活力明顯提高。

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移主要以溶骨性轉(zhuǎn)移為主。乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移、骨微環(huán)境的特殊性以及兩者間的相互作用構(gòu)成了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的主要因素。成骨與破骨細(xì)胞通過分泌一些細(xì)胞因子如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、血管細(xì)胞黏附因子1 等，為乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移提供適宜的微環(huán)境，促進乳腺癌細(xì)胞的趨化、遷移和黏附，而乳腺癌細(xì)胞通過釋放VEGF 等因子與骨基質(zhì)中的受體結(jié)合，從而進一步打破成骨與破骨細(xì)胞維持的動態(tài)平衡，導(dǎo)致骨基質(zhì)的損害與丟失，促使乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。文獻報道，BMP4 可通過抑制MMP-9的活性，抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能[12]。此外，BMP-4 可抑制VEGF-D 驅(qū)動轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)引起血管重塑，從而抑制VEGF-D 可能創(chuàng)建的適宜乳腺癌轉(zhuǎn)移的微環(huán)境[13]。BMP4 可能通過抑制乳腺癌細(xì)胞以及成骨和破骨細(xì)胞分泌的相關(guān)細(xì)胞因子的活性，進而造成破骨和成骨的平衡紊亂，從而在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生進程中發(fā)揮作用。本實驗為了進一步研究BMP4對乳腺癌的影響，通過細(xì)胞劃痕和Transwell 侵襲實驗檢測不同表達水平的BMP4對MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。細(xì)胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)24 h時Lv-BMP4 劃痕愈合率已有低于對照組Lv-NC組的趨勢，而Lv-shBMP4組的劃痕愈合率亦有高于Lv-NC組的趨勢。在48 h，Lv-BMP4組劃痕愈合能力更加顯著，而Lv-shBMP4組的劃痕愈合能力也明顯減小。細(xì)胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組Lv-NC 相比，Lv-BMP4組中穿過Transwell 基質(zhì)膠半透膜到達下表面的細(xì)胞數(shù)量明顯降低，而Lv-NC與空白組Blank組沒有明顯區(qū)別；Lv-shBMP4組與對照組相比，MCF-7細(xì)胞穿過Transwell 小室的數(shù)目顯著升高，說明BMP4 可削弱MCF-7細(xì)胞的體外侵襲能力。本實驗結(jié)果表明，過表達BMP4后MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力減弱，將BMP4 干擾后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷徙和侵襲能力增強。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果表明，BMP4過表達及干擾慢病毒載體構(gòu)建成功，BMP4的表達水平與乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力呈負(fù)相關(guān)。本次實驗僅就BMP4對MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為的改變進行了初步探討。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的、多種因素共同調(diào)節(jié)的過程，對于BMP4在乳腺癌細(xì)胞中的具體作用機制還需進行更深入的研究，需從多個通路綜合研究BMP4的作用機制。