盧文亮 孟衛(wèi)京 薛春梅 楊 靜 寧偉霞 毛國麗 郭興萍

（山西省生殖科學(xué)研究所，太原 030006）

生精細(xì)胞減數(shù)分裂期染色體分析是遺傳學(xué)、組織學(xué)胚胎學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生殖生物學(xué)研究的重要手段[1-2]。染色體是基因的載體，真核細(xì)胞染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)是重要的遺傳指標(biāo)之一[3-4]，優(yōu)良的染色體制片是進(jìn)行染色體顯帶、組型分析、原位雜交等的先決條件。目前，常規(guī)的減數(shù)分裂期染色體制備方法大體分為兩類：體內(nèi)注射秋水仙素法[5-6]和空氣干燥直接制備法[7]。常規(guī)方法制作的小鼠生殖細(xì)胞減數(shù)分裂玻片標(biāo)本，分裂的大部分細(xì)胞處于第一次減數(shù)分裂前期I的部分時(shí)期，如細(xì)線期、偶線期和粗線期。中期分裂相細(xì)胞少，染色體短而不清晰，背景模糊，不易觀察且重復(fù)性差、不穩(wěn)定。筆者參考Evans 等[2，7-12]的方法，優(yōu)化了部分實(shí)驗(yàn)條件，采用改良的體內(nèi)注射秋水仙素法和空氣干燥直接制備法制備小鼠生精細(xì)胞減數(shù)分裂染色體，均獲得理想的效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與試劑

Balb/c小白鼠，雄性，8～12周齡，25～30 g，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。秋水仙素購自廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司；Giemsa 染液購自北京易世盛達(dá)科技發(fā)展有限公司，0.4%KCl、甲醇∶冰乙酸固定液（3∶1）、2.2%檸檬酸鈉、1%檸檬酸鈉、0.9%NaCl 等為常規(guī)分析純配制。

1.2 改良的體內(nèi)注射秋水仙素制備法

改良的體內(nèi)注射秋水仙素制備法在王彬和陳曉東等[2，10]方法基礎(chǔ)上進(jìn)行。雄性小鼠以4 mg/kg腹腔注射秋水仙素，經(jīng)6 h后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出睪丸，去除白膜，用0.9% NaCl液洗去血污，放入裝有2 mL 0.4% KC1液的5 cm培養(yǎng)皿中剪碎（呈乳白色），并輕輕吹打，使生精小管中的各級生精細(xì)胞釋放出來。用70 μm 過濾器過濾到15 mL 刻度離心管中，再加0.4% KC1液至10 mL，37℃靜置30 min，進(jìn)行低滲處理。800～1 000 r/min離心8 min，棄上清；加入10 mL 甲醇冰乙酸固定液（3∶1）輕輕混勻，37℃固定10 min；重復(fù)2次。留少許上清液，制成細(xì)胞混懸液，取潔凈的低溫預(yù)冷載片，梯度滴片、染色并鏡檢，尋找分散良好、染色適中的分裂相，高倍鏡下觀察染色體形態(tài)，并計(jì)數(shù)。

1.3 改良的空氣干燥直接制備法

改良的空氣干燥直接制備法在Evans等[7-9，13]方法基礎(chǔ)上進(jìn)行。脫臼法處死小鼠，取出睪丸，去除被膜和附著的脂肪，并用等滲室溫的2.2%檸檬酸鈉溶液洗去血污。將睪丸轉(zhuǎn)移到新鮮的2.2%檸檬酸鈉溶液中，將生精小管拉出來，用剪刀剪碎，并用合適的尖銳的彎鑷子徹底撕扯生精小管，直到管不透明和平坦為止。將上清液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清液。將沉淀細(xì)胞用3 mL 1%檸檬酸鈉重懸，室溫條件下低滲處理12 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用拇指或示指輕彈來重懸細(xì)胞，以便在管壁上形成薄膜，快速加入0.25 mL甲醇冰乙酸固定液，輕彈混勻，然后逐滴緩緩加固定液到2 mL。室溫下固定3次，每次10 min。用移液管吸取少許懸液，將懸液在室溫下進(jìn)行不同濃度梯度滴片。用PBS（pH 7.4）配制的10%Giemsa染色10～20 min，并鏡檢。

1.4 M期、MⅠ期和MⅡ期細(xì)胞分裂相計(jì)數(shù)及檢出率計(jì)算

體內(nèi)注射法每個(gè)秋水仙素濃度（4、6、8 mg/kg）用3只小鼠制片，直接制備法用3只小鼠制片。每只小鼠制片6張，3個(gè)細(xì)胞濃度梯度，選取其中最適濃度梯度的2 張可供分析的標(biāo)本片進(jìn)行觀察，并計(jì)數(shù)分析。標(biāo)準(zhǔn)為：染色體分散良好，長度適中，背景清晰，精原細(xì)胞有絲分裂中期（M期）染色體數(shù)目40個(gè)，初級精母細(xì)胞減數(shù)第1次分裂中期（MⅠ期）二價(jià)體數(shù)目20個(gè)，次級精母細(xì)胞減數(shù)第2次分裂中期（MⅡ期）染色體數(shù)目20個(gè)。在每只小鼠的2 張玻片上計(jì)數(shù)1 000個(gè)分裂相（每張玻片500個(gè)，2張），分別統(tǒng)計(jì)減數(shù)分裂過程中M期、MⅠ期和MⅡ期分裂相的數(shù)目，并計(jì)算檢出率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生精細(xì)胞中期染色體比較

體內(nèi)注射秋水仙素法獲得的生精細(xì)胞染色體多為第1次減數(shù)分裂前期，呈細(xì)長形，并且邊緣發(fā)毛，不需顯帶處理即可顯示帶紋，其次為精原細(xì)胞有絲分裂中期（M期），減數(shù)第1次分裂中期（MⅠ期）和減數(shù)第2次分裂中期（MⅡ期）的細(xì)胞較少（圖1）。經(jīng)空氣干燥直接制備法獲得的生精細(xì)胞染色體主要為初級和次級精母細(xì)胞分裂相，精原細(xì)胞分裂相少見，染色體明顯呈粗短形，形態(tài)清晰，共40條，初級精母細(xì)胞MⅠ期染色體為二價(jià)體，多進(jìn)行聯(lián)會配對，呈“+”或環(huán)狀，共有40條染色體，形成19個(gè)常染色體和1個(gè)X/Y 配對的性染色體二價(jià)體，性染色體二價(jià)體呈不對稱，這與李建民等[14]報(bào)道一致。次級精母細(xì)胞MⅡ期染色體稍細(xì)長，姐妹染色單體未分離，邊緣不整齊，Giemsa染色均勻，共20條?？諝飧稍镏苯又苽浞ㄖ苽鋾r(shí)間較短（圖1）。

2.2 M期、MⅠ期MⅡ期細(xì)胞分裂相比例分析

用2種方法制備生精細(xì)胞染色體較常規(guī)制片方法均顯著增加，可觀察到許多處于分裂中期的染色體，可以進(jìn)行染色體組型分析。在1 張標(biāo)本片中，可供實(shí)驗(yàn)分析的3種不同階段的睪丸生殖細(xì)胞染色體分裂相，體內(nèi)注射秋水仙素法可觀察到200～300個(gè)，直接制備法為140～200個(gè)。秋水仙素的最佳劑量是4 mg/kg，隨著秋水仙素濃度的升高，減數(shù)分裂各期的分裂相減少，8 mg/kg 秋水仙素處理只能得到少數(shù)的M期分裂相，減數(shù)分裂前期分裂相驟減，空氣干燥直接制備法制得的減數(shù)分裂中期分裂相數(shù)目比4 mg/kg 秋水仙素處理后減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 不同發(fā)育階段的小鼠睪丸生精細(xì)胞中期染色體，Giemsa染色，×1 000，標(biāo)尺=2 μm

表1 兩種方法計(jì)數(shù)1 000個(gè)分裂相中各中期細(xì)胞比例（n=3，±s）

表1 兩種方法計(jì)數(shù)1 000個(gè)分裂相中各中期細(xì)胞比例（n=3，±s）

▲分裂相較少，計(jì)數(shù)總數(shù)為100個(gè)分裂相；ND：無檢出。*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空氣干燥法

方法 劑量(mg/kg) 每只動(dòng)物平均數(shù) 中期細(xì)胞得率（%）M MⅠ MⅡ直接制備法 13.7±3.2 27.6±2.5 23.3±3.5 6.46秋水仙素法 4 22.3±2.1*42.3±3.6** 39.0±2.6** 10.37 6 25.3±1.5 9.3±1.2 12.6±2.5 4.73 8 4.6±1.2▲ ND ND ND

3 討論

染色體制備技術(shù)是遺傳學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵基礎(chǔ)技術(shù)，其中應(yīng)用最成熟的是人外周血染色體制備及分析，已應(yīng)用于臨床診斷與分析[15]。小鼠睪丸細(xì)胞染色體制備技術(shù)為人睪丸細(xì)胞染色體制備提供技術(shù)基礎(chǔ)，具有潛在應(yīng)用價(jià)值，但由于睪丸細(xì)胞染色體制備過程復(fù)雜，影響因素多，在實(shí)際操作過程中要同時(shí)獲得理想的3種中期染色體成功率很低，因此需要進(jìn)一步改進(jìn)優(yōu)化。

本研究比較了秋水仙素注射法和空氣干燥直接制備法制備小鼠睪丸細(xì)胞染色體，并討論了制備過程中的注意事項(xiàng)和改進(jìn)方法。關(guān)于秋水仙素濃度，當(dāng)?shù)蜐B液為0.4%KCl溶液時(shí)，用不同濃度秋水仙素（4、6 mg/kg 和8 mg/kg）處理，結(jié)果顯示秋水仙素的最適濃度為4 mg/kg，這與蘇愛等[17]報(bào)道一致。隨著濃度的增加，中期的細(xì)胞數(shù)量減少，這可能與高濃度秋水仙素法易破壞著絲點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞分裂相減少有關(guān)。當(dāng)?shù)蜐B液為1%檸檬酸鈉時(shí)，秋水仙素為0，即直接制備的效果要好，而6 mg/kg 和8 mg/kg 秋水仙素用量時(shí)分裂相很少。

關(guān)于去被膜及剪碎過程中緩沖液的使用，本研究認(rèn)為等滲溶液即2 %檸檬酸鈉溶液最為合適，可避免在剪碎過程中損傷生精細(xì)胞，影響分裂相得率。關(guān)于撕碎方式，本研究先用剪刀剪碎，再用1 mL注射器撕碎，撕碎后靜置，輕輕吹打100余次，以便使更多的單細(xì)胞從曲細(xì)精管中釋放出來。關(guān)于消化處理，王治喬等[19]報(bào)道用1%胰酶消化可以得到更多的中期細(xì)胞數(shù)，Hoo 等[8]報(bào)道用60%乙酸軟化曲細(xì)精管可獲得更多的中期細(xì)胞，但胰酶和乙酸均可使染色體邊緣發(fā)毛，不整齊。本研究為得到邊緣輪廓清晰的染色體而未采用此方法，同樣獲得了足夠量的各級生精細(xì)胞，且邊緣輪廓清晰。

本研究利用70 μm 細(xì)胞濾器過濾，可去除大塊組織，增加制片效果。關(guān)于低滲及固定條件，本研究結(jié)果顯示低滲條件為37℃30 min，固定條件為卡諾固定液（甲醇∶冰乙酸3∶1）固定2次，每次10 min，且加入固定液后迅速混勻，實(shí)驗(yàn)結(jié)果最佳。關(guān)于離心速度，本研究結(jié)果顯示離心轉(zhuǎn)速1 000～1 500 r/min為宜，＞2 000 r/min時(shí)，未成熟的精子細(xì)胞就會沉淀下來，影響實(shí)驗(yàn)觀察。梯度滴片法（將懸液進(jìn)行不同濃度梯度的滴片）可以很好提高可供分析的分裂相的數(shù)量，成功率比單一的濃縮液滴片效果要好，值得推廣。

綜上所述，通過對2種染色體制備方法進(jìn)行改進(jìn)及比較表明，體內(nèi)注射秋水仙素法可以得到較多的分裂相，而在制備的質(zhì)量上，空氣干燥直接制備法更容易得到輪廓清晰和便于分析的染色體核型，在今后應(yīng)用中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行靈活選用。