周 知 黎業(yè)娟 陳 琳 王安國 阮海玲 馬 寧 周 璟 涂志華

（海南省婦女兒童醫(yī)學中心，生殖醫(yī)學中心，海口 570206）

卵巢早衰指由于卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）之外的各種原因而導致的女性持續(xù)性閉經(jīng)[1-4]。癌癥（腫瘤）患者接受化療藥物治療容易引起機體免疫力低下，可導致機體生殖系統(tǒng)嚴重損傷，引起卵巢早衰。化療性損傷已成為女性生殖疾病的重要原因[5-6]。細胞凋亡在卵泡發(fā)育中起著重要作用，主要表現(xiàn)在卵子的產(chǎn)生、卵母細胞的變性、卵泡的選擇甚至卵泡的閉鎖等方面。卵巢早衰患者細胞凋亡可能失調?；诼雅蓊w粒細胞是維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要生理過程，其凋亡過程與Bcl-2家族相關。卵巢早衰大鼠卵巢內存在大量小卵泡，由于下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂，可能存在卵泡選擇或卵泡閉鎖等卵巢功能失調，缺乏成熟卵泡。本研究主要觀察化療藥物引起的卵巢早衰大鼠血清中Bcl-2、Bax蛋白的水平及其在卵巢組織中的表達水平的變化，并進一步探討化療引起的卵巢早衰大鼠的卵巢形態(tài)變化和性激素水平異常與血清和卵巢組織中Bcl-2、Bax蛋白之間的關系。

1 材料和方法

1.1 模型制備與分組

選用SPF級2月齡左右的性成熟雌性SD大鼠120只，體質量為245～265 g。適應性飼養(yǎng)1周之后，隨機分為對照組（20只）和造模組（100只）。按照Li 等[8]方法每天于下午4∶00、將順鉑（1.5 mg/kg）稀釋于1 mL 生理鹽水進行腹腔注射，連續(xù)10 d，制備卵巢早衰模型，在室溫下飼養(yǎng)。對照組放置于正常環(huán)境中飼養(yǎng)。每周對大鼠進行陰道涂片實驗，監(jiān)測大鼠動情周期，觀察大鼠的一般情況變化（主要根據(jù)生物行為學）及大鼠發(fā)情周期的變化。使用毛細管從大鼠的眼眶靜脈叢取血，離心后取上層血清，放射免疫測定法測定各組大鼠血清中雌二醇（estradiol，E2）、FSH 和LH含量。將模型組中大鼠的激素含量與正常對照組進行比較，根據(jù)以上激素水平、大鼠動情周期及生物行為學的變化篩選出卵巢早衰的大鼠，并將它們隨機分為卵巢早衰模型組，羅布麻顆粒高、中、低劑量治療組（由于化療藥物藥性強，27只大鼠在造模過程中死亡，剩余73只大鼠用于后期的實驗），高、中、低劑量為按照成人劑量與大鼠劑量關系換算分別為46.86、23.43、11.72 mL/kg，其中高劑量組與中劑量組分早晚2次灌胃。每3 d 進行藥物治療1次，時間為2周。給藥結束后將所有大鼠麻醉，隨后腹主動脈取血，分離血清備用；取兩側卵巢，一側用于H-E染色，一側用于免疫組織化學檢測。

1.2 H-E染色

大鼠卵巢組織經(jīng)固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、烘干等處理，備做H-E染色。

1.3 ELISA檢測

嚴格按照ELISA試劑盒說明書要求，測定大鼠血清E2、FSH、LH水平及Bcl-2、Bax的含量，在酶標儀上450 nm 波長依序測量各孔吸光度（OD）值。

1.4 免疫組織化學顯色

切片脫蠟，抗原修復，加稀釋好的Bcl-2、Bax抗體（Bcl-2為1∶200，Bax為1∶100），加適量生物素標記二抗工作液，顯色劑顯色，自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察染色結果。卵巢組織標本中細胞質出現(xiàn)淡黃色或黃色顆粒狀著色為陽性表達。采用IPP 6.0 軟件在同等條件下檢測每張組織切片中的Bcl-2、Bax表達的積分光密度（IOD）值。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進一步兩兩比較用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠卵巢卵泡發(fā)生情況

卵巢早衰模型組大鼠中，未見明顯的初級卵泡，原始的卵泡幾乎沒有，閉鎖卵泡增多，說明卵巢水腫嚴重；羅布麻顆粒高劑量治療組大鼠可見初級卵泡，閉鎖卵泡較卵巢早衰模型組減少（圖1，見封二）。

2.2 大鼠血清中E2、FSH、LH、Bcl-2、Bax的變化

與對照組比較，卵巢早衰模型組大鼠血清中E2 及Bcl-2含量降低（P＜0.05），F(xiàn)SH、LH、Bax的含量升高（P＜0.05）；各藥物治療組與卵巢早衰模型組比較，E2、Bcl-2含量升高，F(xiàn)SH、LH、Bax的含量降低（P＜0.05）（表1）。

2.3 大鼠卵巢Bax 和Bcl-2蛋白的表達

結果顯示（圖2，見封二），Bax蛋白主要在對照組大鼠卵巢顆粒層細胞中表達，黃體中少量表達（3.92±0.49）；在卵巢早衰模型組大鼠卵巢顆粒層細胞、黃體及間質中高度表達（10.21±0.85）；經(jīng)過羅布麻顆粒治療后，Bax蛋白在各組卵巢中的表達呈不同程度下降趨勢，其中羅布麻顆粒高劑量治療組（7.12±0.59）相對于中劑量治療組（7.92±0.62）、低劑量治療組（8.89±0.75），治療效果最為顯著。Bcl-2蛋白主要在對照組大鼠卵巢顆粒層細胞中表達（6.73±0.52）；在卵巢早衰模型組大鼠卵巢顆粒層細胞、黃體及間質中低表達（3.14±0.79），Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05），且Bcl-2/Bax比值明顯下降（P＜0.05）。與卵巢早衰模型組比較，羅布麻顆粒高劑量治療組（6.43±0.73）、中劑量治療組（5.14±1.07）、低劑量治療組（3.98±1.36）大鼠卵巢Bcl-2蛋白表達升高（P＜0.01），且Bcl-2/Bax比值明顯上升（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠卵巢卵泡發(fā)生情況，H-E染色，×100。A：對照組；B：卵巢早衰模型組；C：羅布麻顆粒高劑量治療組；D：羅布麻顆粒中劑量治療組；E：羅布麻顆粒低劑量治療組.

圖2 各組大鼠卵巢組織Bax（A1～E1）和Bcl-2（A2～E2）的表達，×200。A1、A2：對照組；B1、B2：卵巢早衰模型組；C1、C2：羅布麻顆粒高劑量治療組；D1、D2：羅布麻顆粒中劑量治療組；E1、E2：羅布麻顆粒低劑量治療組.

表1 各組大鼠血清中E2、FSH、LH、Bcl-2、Bax含量的變化（±s）

表1 各組大鼠血清中E2、FSH、LH、Bcl-2、Bax含量的變化（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs 對照組；#P＜0.05vs 卵巢早衰模型組

組別 n E2（pg/mL）FSH（mlU/mL）LH（mlU/mL）Bcl-2（pg/mL）Bax（mlU/mL）對照組 18 49.17±5.87 2.34±0.67 3.72±1.13 49.17±5.87 2.34±0.67卵巢早衰模型組 18 21.09±7.80** 8.57±0.89** 8.84±1.51** 21.09±7.80*8.57±0.89*高劑量治療組 17 38.81±6.11# 4.14±0.35# 4.75±0.45# 38.81±6.11# 4.34±0.76#中劑量治療組 19 33.97±5.56 4.89±0.35# 5.45±0.87# 33.97±5.56# 5.94±0.35低劑量治療組 19 31.97±4.63 5.34±0.76 5.82±1.17 31.14±4.35 7.11±0.35

3 討論

現(xiàn)實生活中造成卵巢早衰的病因眾多，涉及激素水平異常、免疫因素、化療藥物、環(huán)境因素和各種不明原因等，目前很多的學者認為卵巢早衰是可能具有高度特異性、遺傳和環(huán)境相互交叉作用的多因素疾病[7-8]。本課題組對于化療型卵巢早衰的治療采用中藥羅布麻顆粒進行治療。羅布麻包含肉桂、苜蓿子、韭菜子、大葉補血草、蒺藜、紫茉莉根、肉豆蔻衣、肉豆蔻、白皮松子、芝麻菜子、西紅花等藥物成分[9-10]。羅布麻在臨床上主要用于治療免疫力低下、體虛、消瘦、神經(jīng)衰弱等，具有溫補腦腎、益心填精的功效，對調節(jié)和增強免疫力也有較好的功效。

化療型卵巢損傷是一種嚴重女性生殖疾病，目前缺乏有效的治療方法。由于化療型卵巢早衰越來越普遍，因此迫切需要尋找新的治療方法。本研究中，順鉑誘導化療型卵巢損傷后，卵巢儲備功能明顯下降，卵巢細胞的凋亡加快，導致卵池中初級卵母細胞減少，卵巢功能衰竭，從而造成卵巢3早衰[11]。

本研究探討了凋亡信號通路中Bcl-2家族成員對卵巢細胞凋亡的影響。Bcl-2家族能對細胞表面或內部的死亡信號作出反應，并影響凋亡小體的形成和caspase級聯(lián)的激活，促進Bcl-2 及Bax的過表達，加快卵巢細胞凋亡，即Bax 和Bcl-2 起著“變阻器”的作用[12-13]。本研究結果提示Bax 和Bcl-2蛋白參與了卵巢濾泡顆粒細胞的凋亡。卵巢早衰大鼠濾泡顆粒細胞凋亡增加，尤其是竇性濾泡，羅布麻顆粒治療可減緩卵巢濾泡顆粒細胞凋亡，升高Bcl-2 在血清中的含量，進一步阻止卵泡閉鎖的發(fā)生發(fā)展，從而進入竇性卵泡的募集。

化療隨之帶來的是身體內分泌的紊亂及其他組織器官的損傷，尤其是生殖系統(tǒng)損傷最為嚴重，造成機體免疫力低下[14]。本研究通過順鉑建立化療藥物致卵巢早衰大鼠模型，在此基礎上觀察研究羅布麻顆粒對卵巢早衰模型大鼠血清性激素水平以及卵巢形態(tài)的影響。結果顯示，Bcl-2、Bax蛋白主要在正常大鼠卵巢顆粒層細胞中表達，黃體中少量表達，Bcl-2、Bax蛋白在模型組中大鼠顆粒層細胞、黃體及間質中高度表達，Bcl-2/Bax比值較明顯下降，提示卵巢Bax蛋白上調，Bcl-2蛋白下調可能加快大鼠卵巢顆粒細胞的凋亡，從而導致大鼠卵泡閉鎖以及水腫，引起卵巢早衰。與卵巢早衰模型組比較，羅布麻顆粒高、中、低劑量治療組大鼠卵巢Bax蛋白表達減少，且Bcl-2/Bax 明顯上升，提示不同劑量的羅布麻顆粒能夠增加Bcl-2蛋白在卵巢組織中的表達，減少Bax蛋白在卵巢組織中的表達，使Bcl-2/Bax比例升高，從而抑制卵巢顆粒細胞的過度凋亡，減少卵泡閉鎖，改善卵巢功能，抑制卵巢的進一步衰退。