朱曉燕，姚冬穎，郭 軍，郭 治，楊 華，靳 毅

河北省邢臺市人民醫(yī)院：1.腫瘤內(nèi)二科；2.病理科，河北邢臺 054000

結(jié)腸癌是消化道常見惡性腫瘤，好發(fā)于乙狀結(jié)腸與直腸交界處。據(jù)統(tǒng)計，我國每年新增結(jié)直腸癌患者約29.44萬例，發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第3位，高發(fā)群體為40～50歲人群，男女發(fā)病率之比為2∶1～3∶1，全球每年新增結(jié)直腸癌死亡病例約14.23萬例，病死率居所有惡性腫瘤的第5位，且近年來結(jié)腸癌發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)上升趨勢[1-2]。早發(fā)現(xiàn)、早治療是提升結(jié)腸癌預(yù)后的關(guān)鍵，因此探索結(jié)直腸癌發(fā)病機制對早期診治、延長生存期具有重要價值。蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)是一種染色質(zhì)修飾酶，在細胞增殖、分化、凋亡等細胞生物學(xué)行為及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要作用[3]。環(huán)狀蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(circPRMT5)具有穩(wěn)定的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，能夠調(diào)控表觀遺傳和細胞生物學(xué)行為[4]。既往研究顯示，膀胱尿路上皮癌、前列腺癌等惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展與circPRMT5異常表達有關(guān)[5]，但circPRMT5與結(jié)腸癌的關(guān)系仍處于探索階段。因此本研究就circPRMT5在結(jié)腸癌患者中的表達及其對生物學(xué)性質(zhì)的影響進行了分析，以期為臨床防治結(jié)腸癌提供參考依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年10月至2019年10月本院收治的93例結(jié)腸癌患者為研究對象，收集其手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織，其中男58例，女35例；年齡20～80歲，平均(52.26±5.34)歲。納入標準：(1)結(jié)腸癌經(jīng)病理活檢確診[1]；(2)入院前未接受任何抗結(jié)腸癌治療；(3)依從性好，能配合完成本研究；(4)簽訂知情同意書。排除標準：(1)病歷資料不齊全；(2)心、肝、腎、肺、腦等重要臟器功能不全；(3)合并其他胃腸道疾病、其他惡性腫瘤、過敏性疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病、傳染性疾病、精神系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病；(4)哺乳期或妊娠期女性。本研究上報本院醫(yī)學(xué)倫理委員會并獲得批準。

1.2方法 (1)采用免疫印跡法(Western blot)檢測結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中circPRMT5蛋白表達量。取結(jié)腸癌患者癌組織及癌旁正常組織，剪碎后置于玻璃勻漿器(北京凱瑞基生物科技有限公司)，加入RIPA裂解液(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)，勻漿，采用細胞離心機(北京鼎昊源科技有限公司，型號：CellSmart)，以13 000 r/min離心15 min，取上清液，使用BCA試劑盒(上海榕柏生物技術(shù)有限公司)測定蛋白濃度，對蛋白定量，取總蛋白上樣于10%的SDS-PAGE凝膠(北京綠源伯德生物科技有限公司)中，進行電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉液(上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司)封閉，加入1∶200稀釋的兔抗circPRMT5單克隆抗體(上海晅科生物科技有限公司)、1∶500稀釋的兔抗GAPDH單克隆抗體(北京博爾西科技有限公司)，4 ℃孵育過夜，TBST溶液(武漢愛博泰克生物科技有限公司)洗膜，加入1∶4 000稀釋的HRP標記山羊抗兔IgG二抗(北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司)，37 ℃孵育60 min，TBST溶液洗膜，采用ECL發(fā)光試劑盒(上海銳賽生物技術(shù)有限公司)顯色，洗片后顯影、定影，應(yīng)用Image Quant TL軟件(北京碧橙藍生物科技有限責任公司)進行分析，GAPDH為內(nèi)參蛋白，以circPRMT5灰度值與GAPDH灰度值之比表示circPRMT5蛋白表達量。(2)細胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)。將人結(jié)腸癌SW480細胞(上海圻明生物科技有限公司)分為空白對照組、陰性對照組、試驗組，進行原代培養(yǎng)，待細胞融合度達80%時，消化、傳代，取對數(shù)生長期的SW480細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，細胞接種密度為5×106個/孔，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(上海信裕生物科技有限公司)，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱(北京博勱行儀器有限公司)中培養(yǎng)，待細胞融合度達90%時，空白對照組不作任何處理，陰性對照組轉(zhuǎn)染10 μg pEGFP-N1質(zhì)粒(武漢淼靈生物科技有限公司)，試驗組轉(zhuǎn)染10 μg pEGFP-N1-circPRMT5質(zhì)粒(上海漢恒生物公司)，轉(zhuǎn)染結(jié)束繼續(xù)培養(yǎng)48 h。所有轉(zhuǎn)染操作按照北京嘉美臻元生物技術(shù)有限公司的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明書進行。(3)采用Western blot檢測各組SW480細胞中circPRMT5蛋白表達量，操作同上。(4)采用CCK-8法檢測各組SW480細胞增殖能力。取轉(zhuǎn)染后的各組SW480細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞接種密度為2×103個/孔，每孔加入100 μL細胞懸液和10 μL CCK-8溶液(上海富衡生物科技有限公司)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，采用酶標儀(蘇州亞凡生物技術(shù)有限公司，型號：M2e)測定550 nm波長下各孔吸光度值，計算SW480細胞增殖率=(處理組吸光度值/空白對照組吸光度值)×100%。(5)采用Transwell小室侵襲試驗檢測各組SW480細胞侵襲能力：取轉(zhuǎn)染后的各組SW480細胞制成細胞懸液，在Transwell小室的上室鋪入基質(zhì)膠(上?；菅猩锟萍加邢薰?，每孔60 μL，然后加入細胞懸液，每孔200 μL，在Transwell小室的下室加入600 μL DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，24 h后棄上室液體，4%多聚甲醛溶液(北京索萊寶科技有限公司)固定細胞，風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫(青島達斐生物科技有限公司)染色，PBS溶液(蘇州瑞諾德生物科技有限公司)漂洗，于熒光顯微鏡(南京新惠通生物科技有限公司，型號：Revole)下觀察并計算穿過小室膜的平均細胞數(shù)，以此判定SW480細胞侵襲能力。(6)采用流式細胞術(shù)檢測各組SW480細胞凋亡率。取轉(zhuǎn)染后的各組SW480細胞制成細胞懸液，用1 mol/L×Tris Buffer緩沖液(上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司)洗滌，經(jīng)0.25%胰蛋白酶(上海北諾生物科技有限公司)消化，制備細胞懸液，結(jié)合1 mol/L×Tris Buffer緩沖液重懸細胞，于流式管中依次加入300 μL細胞懸液、5 μL異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC，武漢益普生物科技有限公司)避光反應(yīng)15 min，再加入200 μL 1 mol/L×Tris Buffer緩沖液及5 μL碘化丙啶(PI)染液(上海繼錦化學(xué)科技有限公司)，混勻，1 h內(nèi)使用流式細胞儀(深圳市達科為生物技術(shù)股份有限公司，型號：EXFLOW-206)檢測SW480細胞凋亡率。所有試驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中circPRMT5蛋白表達量 結(jié)腸癌組織中circPRMT5蛋白表達量(2.79±1.23)顯著高于癌旁正常組織(0.58±0.12)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.197，P<0.05)。見圖1。

注：A為癌旁正常組織，B為結(jié)腸癌組織；GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

2.2各組SW480細胞增殖率的比較 試驗組SW480細胞增殖率(88.83%±5.19%)顯著高于空白對照組(53.48%±3.77%)、陰性對照組(53.32%±3.90%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陰性對照組SW480細胞增殖率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組SW480細胞侵襲能力 試驗組SW480細胞穿過小室膜的細胞數(shù)[(37.24±5.92)個]顯著高于空白對照組[(13.38±2.64)個]、陰性對照組[(13.52±2.53)個]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陰性對照組SW480細胞穿過小室膜的細胞數(shù)與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 各組SW480細胞侵襲能力

2.4各組SW480細胞凋亡率的比較 試驗組SW480細胞凋亡率(7.77%±2.25%)顯著低于空白對照組(15.51%±3.83%)、陰性對照組(15.28%±3.87%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陰性對照組SW480細胞凋亡率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5各組SW480細胞中circPRMT5蛋白表達量 試驗組SW480細胞中circPRMT5蛋白表達量(2.95±1.18)顯著高于空白對照組(1.78±0.53)、陰性對照組(1.81±0.49)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陰性對照組SW480細胞凋亡率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

注：GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

3 討 論

結(jié)腸癌是指結(jié)腸黏膜上皮在多種致癌因素作用下導(dǎo)致的惡性病變，早期通常表現(xiàn)為腹脹、消化不良、排便習(xí)慣異常變化、腹瀉與便秘交替等不具備特異性的癥狀，隨著疾病不斷發(fā)展，癌細胞可轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)、肺、骨、肝、腦等組織臟器，出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、肺水腫、腸梗阻、腹部腫塊、腹腔積液等轉(zhuǎn)移表現(xiàn)，危害極大[6]。隨著人們生活水平提高，飲食結(jié)構(gòu)變化，生活習(xí)慣改變，結(jié)腸癌發(fā)病率逐年增加，對人類生命安全造成嚴重威脅[7]。臨床目前治療結(jié)腸癌主要采用手術(shù)、放射性治療、化學(xué)藥物治療等相結(jié)合的綜合性治療方案，能夠緩解臨床癥狀，縮小原發(fā)癌灶，減緩腫瘤發(fā)展速度，降低復(fù)發(fā)率，但手術(shù)無法徹底切除癌組織，癌細胞易擴散轉(zhuǎn)移，患者往往預(yù)后不良[8]。因此探索結(jié)腸癌發(fā)病機制成為臨床的研究熱點。

結(jié)腸癌發(fā)病是一個多因素、多步驟、多途徑的復(fù)雜過程，除家族史、潰瘍性結(jié)腸炎、高脂飲食、結(jié)腸息肉、低纖維素飲食等因素外，也涉及分子遺傳學(xué)改變[9]。隨著分子生物學(xué)理論不斷完善、實驗技術(shù)的迅速發(fā)展、基因?qū)W的深入研究，分子生物標志物成為惡性腫瘤研究的熱點，且被應(yīng)用于惡性腫瘤早期診斷、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷。PRMT5是一種Ⅱ型蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，廣泛表達于哺乳動物細胞中，能催化甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到精氨酸蛋白的殘基上，并在細胞增殖、分化、凋亡等細胞生物學(xué)行為以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要作用[10]。PRMT5在結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、皮膚癌、乳腺癌、子宮頸癌、膀胱癌等惡性腫瘤中過表達，過表達的PRMT5可通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路等調(diào)控腫瘤基因表達，影響腫瘤細胞生物學(xué)行為，進而影響腫瘤發(fā)生及發(fā)展[11]。circPRMT5具有穩(wěn)定的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，能夠參與染色質(zhì)重塑、基因轉(zhuǎn)錄、RNA代謝、高爾基體結(jié)構(gòu)維持、調(diào)控細胞增殖及分化等，是具有一定前景的臨床分子標志物。有研究發(fā)現(xiàn)，circPRMT5在前列腺癌患者外周血中呈高表達狀態(tài)，能夠促進前列腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，circPRMT5在結(jié)直腸癌患者癌組織中亦呈高表達[13]，本研究結(jié)果與此報道結(jié)果一致，提示circPRMT5高表達可能與結(jié)腸癌發(fā)病有關(guān)。本研究顯示，試驗組SW480細胞增殖率、侵襲能力、circPRMT5蛋白表達量顯著高于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)，試驗組SW480細胞凋亡率顯著低于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)，提示circPRMT5高表達能夠促進結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲，抑制結(jié)腸癌細胞凋亡，這與JING等[14]和ZHU等[15]的研究結(jié)果相符，JING等[14]研究顯示circPRMT5表達水平與結(jié)腸癌患者腫瘤最大徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度呈正相關(guān)；ZHU等[15]研究顯示沉默circPRMT5表達能夠促進結(jié)腸癌細胞凋亡并誘導(dǎo)線粒體膜電位(MMP)下降。分析其原因，circPRMT5高表達可能通過激活鋅指轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的EMT，從而促進結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲，抑制結(jié)腸癌細胞凋亡，使結(jié)腸癌惡性程度更高。

綜上所述，circPRMT5在結(jié)腸癌患者中呈高表達，circPRMT5高表達能夠促進結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲，抑制結(jié)腸癌細胞凋亡。但由于本研究受到試驗條件、儀器精度、研究時間、納入病例數(shù)等因素限制，故此結(jié)論仍有待進一步證實。