賴(lài)志亨，鄒 江

海南省中醫(yī)院肛腸科，海南海口 570203

結(jié)直腸癌是全球發(fā)病率僅次于肺癌和乳腺癌的第三大癌癥，其病死率僅次于肺癌，每年導(dǎo)致約60萬(wàn)例腫瘤相關(guān)病例死亡[1]。雖然結(jié)直腸癌的治療有效率在不斷提高，但是患者的生存率和生存質(zhì)量仍然不盡如人意，因此急需研究新的治療方法[2]。結(jié)直腸癌是一種復(fù)雜的多基因疾病，其具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，許多研究已經(jīng)證實(shí)lncRNA異常表達(dá)是結(jié)直腸癌發(fā)病的重要調(diào)控機(jī)制之一[3-4]。LINC00261是腫瘤相關(guān)lncRNA之一，在非小細(xì)胞肺癌和肝細(xì)胞肝癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌因子的作用[5-6]。lncRNA通常作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(ceRNA)結(jié)合微小RNA(miRNA)發(fā)揮作用[7]。在非小細(xì)胞肺癌中LINC00261通過(guò)與微小RNA-522-3p(miR-522-3p)直接結(jié)合發(fā)揮抑癌作用[8]。miR-522-3p是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA，其可有效促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[9]。目前LINC00261、miR-522-3p與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究較少，二者在結(jié)直腸癌中是否具有調(diào)控作用尚不清楚。本研究旨在探討LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及相關(guān)性，并分析了二者與患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2014年12月在本院行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象。共納入結(jié)直腸癌組織標(biāo)本68例和其配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本68例?；颊吣挲g36～75歲，平均(65.51±8.38)歲；男42例，女26例；部位：結(jié)腸38例，直腸30例；腫瘤最大徑：≤5 cm 50例，>5 cm 18例；浸潤(rùn)深度：T1 33例，T2 21例，T3 10例，T4 4例；分化程度：高分化30例，中分化26例，低分化12例；臨床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期21例，Ⅲ期20例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無(wú)21例，有47例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均初次進(jìn)行手術(shù)治療，且未接受過(guò)其他任何形式的抗腫瘤治療；(2)均獲得手術(shù)切除組織，并經(jīng)病理專(zhuān)家證實(shí)為結(jié)直腸癌組織和癌旁組織；(3)具有完整的臨床病理資料和隨訪(fǎng)資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移；(2)合并有其他類(lèi)型的腫瘤；(3)合并有嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑購(gòu)自北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司，氯仿、異丙醇和無(wú)水乙醇購(gòu)自天津風(fēng)船化工有限公司；DEPC水購(gòu)自上海生工有限公司；Nanodrop2000購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡPCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；LINC00261、miR-522-3p和內(nèi)參U6引物由美國(guó)Invitrogen有限公司合成。7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR 手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織立即凍于液氮中，采用研缽將其研磨后加入Trizol試劑1 mL裂解，移至EP管后加入氯仿200 μL混勻靜置5 min，4 ℃高速離心30 min，吸取最上層水相層溶液450 μL與等體積的異丙醇混勻后4 ℃高速離心30 min，可見(jiàn)EP管底部白色沉淀為RNA，無(wú)水乙醇洗滌兩次，加入DEPC水溶解RNA，測(cè)得RNA純度(A260 nm/A280 nm為1.8～2.0時(shí)，純度較高)和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×PrimeScript Buffer 24 μL，PrimeScript RT Enzyme mix Ⅰ 1 μL，Oligo dT primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，總RNA 0.5 μg，RNase Free H2O補(bǔ)足20 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 30 s將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。

以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制qRT-PCR反應(yīng)體系，cDNA模板2 μL、ddH2O 2 μL、引物F 0.4 μL、引物R 0.4 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ 5 μL，總體積10 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上機(jī)檢測(cè)各樣品的循環(huán)閾值(Ct)。采用2-ΔΔCt公式以U6基因?yàn)閮?nèi)參，計(jì)算LINC00261和miR-522-3p的相對(duì)表達(dá)量。LINC00261引物F：5′-ACA TTT GGT AGC CCG TGG AG-3′；R：5′-TCT TCC CCG GAG AAC TAG CA-3′。miR-522-3p引物F：5′-GGG CTC TAG AGG GAA GCG C-3′；R：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′。內(nèi)參U6引物F：5′-CTT CGG CAG CAC ATA TAC T-3′；R：5′-AAA ATA TGG AAC GCT TCA CG-3′。

1.3.2隨訪(fǎng)方法 患者術(shù)后采用電話(huà)詢(xún)問(wèn)或者門(mén)診查詢(xún)的方式每隔3個(gè)月隨訪(fǎng)1次，直至患者死亡或者完成5年隨訪(fǎng)時(shí)間時(shí)截止。

2 結(jié) 果

2.1LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平 LINC00261在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平低于其在癌旁組織中的表達(dá)水平(P<0.05)，miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平高于其在癌旁組織中的表達(dá)水平(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2結(jié)直腸癌組織中LINC00261、miR-522-3p表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 LINC00261在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑和浸潤(rùn)深度均無(wú)關(guān)(P>0.05)，與分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P<0.05)。miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、浸潤(rùn)深度和分化程度均無(wú)關(guān)(P>0.05)，與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.3結(jié)直腸癌組織中LINC00261、miR-522-3p表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響 對(duì)68例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行隨訪(fǎng)，其中35例死亡，33例存活，5年生存率為48.53%。

根據(jù)LINC00261在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平分為L(zhǎng)INC00261高表達(dá)組(>0.64，32例)和LINC00261低表達(dá)組(≤0.64，36例)。LINC00261高表達(dá)組的5年生存率為65.63%(21/32)，LINC00261低表達(dá)組的5年生存率為33.33%(12/36)。繪制Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)，Log Rank檢驗(yàn)分析顯示LINC00261低表達(dá)組的預(yù)后比LINC00261高表達(dá)組預(yù)后更差(χ2=5.762，P=0.021)。

根據(jù)miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平分為miR-522-3p高表達(dá)組(>1.79，33例)和miR-522-3p低表達(dá)組(≤1.79，35例)。miR-522-3p高表達(dá)組的5年生存率為36.36%(12/33)，miR-522-3p低表達(dá)組的5年生存率為60.00%(21/35)。繪制Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)，Log Rank檢驗(yàn)分析顯示miR-522-3p高表達(dá)組的預(yù)后比miR-522-3p低表達(dá)組的預(yù)后更差(χ2=8.710，P=0.016)。

2.4多因素Cox回歸分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良因素 建立Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，以本研究資料為樣本，以直腸癌患者預(yù)后狀況為應(yīng)變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期。經(jīng)臨床和統(tǒng)計(jì)專(zhuān)家討論決定，以L(fǎng)INC00261和miR-522-3p表達(dá)及表2中P<0.10的指標(biāo)/因素為自變量。此外，為提高統(tǒng)計(jì)效率并使回歸結(jié)果清晰，將原為連續(xù)數(shù)值的LINC00261和miR-522-3p表達(dá)指標(biāo)，按其均值進(jìn)行分段(分層)，轉(zhuǎn)化成高和低表達(dá)的兩分類(lèi)變量。各變量賦值如下：分化程度中，1為低分化，0為中高分化；臨床分期中，1為Ⅲ期，0為Ⅰ+Ⅱ期；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，1為有，0為無(wú)；LINC00261表達(dá)中，1為L(zhǎng)INC00261表達(dá)水平<0.64，0為L(zhǎng)INC00261表達(dá)水平≥0.64；miR-522-3p表達(dá)中，1為miR-522-3p表達(dá)水平>1.79，0為miR-522-3p表達(dá)水平≤1.79?；貧w過(guò)程采用逐步后退法，以進(jìn)行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05。多因素Cox回歸結(jié)果顯示，高臨床分期、低分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LINC00261低表達(dá)和miR-522-3p高表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，HR>1)，見(jiàn)表3。

表3 多因素Cox回歸分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

2.5LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，LINC00261與miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.422，P<0.001)。

3 討 論

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均較高，隨著飲食習(xí)慣的改變和生活壓力的增加，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[10]。手術(shù)是結(jié)直腸癌最有效的治療方法，主要針對(duì)結(jié)直腸癌早期患者，約90%的結(jié)直腸癌早期患者可以通過(guò)手術(shù)治愈，患者的5年生存率約為90%[11]。但是結(jié)直腸癌的早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，出現(xiàn)病灶轉(zhuǎn)移，治療方式為手術(shù)切除原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶，輔助化學(xué)治療和放射治療，但治療效果不佳，晚期結(jié)直腸癌患者5年生存率僅10%[2]。通過(guò)靶向治療與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵分子，可以改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，瑞戈非尼、阿帕替尼、呋喹替尼及安羅替尼等小分子靶向藥物已經(jīng)在晚期結(jié)直腸癌治療中取得了較好的療效[12]，但是存在耐藥現(xiàn)象，仍然達(dá)不到理想的療效，因此研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵分子，探討結(jié)直腸癌新的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

lncRNA是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的調(diào)控[13]。lncRNA可充當(dāng)癌基因和抑癌基因，在腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并可以作為調(diào)控腫瘤進(jìn)展的分子靶點(diǎn)[14]。LINC00261可在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用，ZHOU等[15]采用原位雜交發(fā)現(xiàn)，LINC00261在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的陰性率高于其附近非癌組織，并與結(jié)腸癌患者的臨床分期相關(guān)，LINC00261表達(dá)水平降低是影響結(jié)腸癌患者術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，LINC00261在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平降低，LINC00261的表達(dá)水平與分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與ZHOU等[15]的報(bào)道基本一致，這提示LINC00261可能參與了結(jié)直腸癌的進(jìn)展。另一方面，LINC00261低表達(dá)組的預(yù)后較差，LINC00261低表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這表明LINC00261可作為預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

miR-522-3p在慢性炎癥中首次被報(bào)道[16]，目前的研究較少，炎癥與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其能否通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與結(jié)直腸癌的進(jìn)展尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)增加，其表達(dá)水平與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，且miR-522-3p高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的預(yù)后較差，miR-522-3p高表達(dá)是患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這表明miR-522-3p可能參與結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展，是患者預(yù)后不良的分子標(biāo)志物。SHUAI等[17]報(bào)道在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中miR-522-3p的表達(dá)增加，miR-522-3p過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞凋亡率，發(fā)揮促癌基因的作用。CHEN等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-522-3p在骨肉瘤中亦呈異常高表達(dá)狀態(tài)，且miR-522-3p高表達(dá)的患者的預(yù)后較差。

miRNA是lncRNA重要調(diào)控機(jī)制之一，且一個(gè)lncRNA可靶向調(diào)控多個(gè)miRNA，YAN等[18]報(bào)道LINC00261在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低，過(guò)表達(dá)LINC00261可靶向調(diào)節(jié)miR-324-3p的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移、侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響結(jié)腸癌的進(jìn)展。此外，在非小細(xì)胞肺癌中LINC00261通過(guò)調(diào)節(jié)miR-522-3p抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]，而LINC00261是否調(diào)控miR-522-3p的表達(dá)參與結(jié)直腸癌的疾病進(jìn)展尚不清楚。本研究采用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，lncRNA可競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA，因此推測(cè)LINC00261可能是通過(guò)抑制miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中發(fā)揮作用，但是具體的作用機(jī)制將在后續(xù)的細(xì)胞水平中進(jìn)行研究。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中LINC00261低表達(dá)，miR-522-3p高表達(dá)。LINC00261和miR-522-3p均與結(jié)直腸癌患者不良病理參數(shù)和預(yù)后相關(guān)，兩者在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。LINC00261和miR-522-3p是結(jié)直腸癌患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。