李雄飛，胡 偉，周明安，田少斌

湖北省天門市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北天門 431700

腦外傷是常見的神經(jīng)外科急癥，腦外傷患者主要臨床特征有認(rèn)知功能、語言功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎性反應(yīng)是腦損傷的并發(fā)癥之一，神經(jīng)炎癥治愈難，容易復(fù)發(fā)，最終導(dǎo)致患者神經(jīng)功能受損[1-2]。繼發(fā)性癲癇是重度腦外傷常見的并發(fā)癥。癲癇是由于腦部神經(jīng)元異常導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常，癲癇反復(fù)發(fā)作會導(dǎo)致腦功能損傷。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，微小RNA參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腦缺血所致神經(jīng)損傷[3]；也有研究顯示，微小RNA在癲癇的發(fā)生中起重要作用[4]。微小RNA-146a(miR-146a)是一種調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLRs)信號通路和炎癥因子受體信號通路的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[5]。但是目前鮮有文獻(xiàn)報道重度腦外傷患者中miR-146a與癲癇發(fā)病的關(guān)系。本文旨在研究重度腦外傷患者血清miR-146a水平與繼發(fā)性癲癇之間相關(guān)性，為早期干預(yù)和治療重度腦外傷繼發(fā)性癲癇提供新依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年2月本院收治的重度腦外傷住院患者104例為研究對象，其中男60例，女44例；年齡23～76歲，平均(38.92±15.86)歲。按照是否繼發(fā)癲癇分為重度腦外傷繼發(fā)性癲癇組61例，單一重度腦外傷組43例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)重度腦外傷診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《重型顱腦損傷救治指南》[6]；(2)癲癇的診斷依據(jù)2010年國際抗癲癇聯(lián)盟(ILAE)制定的癲癇發(fā)作和癲癇綜合征的分類方法[7]，結(jié)合臨床表現(xiàn)、腦電圖、頭顱MRI、家族史等診斷為原發(fā)性癲癇；(3)重度腦外傷后出現(xiàn)2次以上癲癇發(fā)作；(4)外傷前無癲癇病史，無家族遺傳史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有腦出血、腦梗死病史；(2)有腦血管畸形者；(3)患有自身免疫性疾病者；(4)有癲癇病史或家族遺傳癲癇者；(5)其他原因引起繼發(fā)性癲癇者；(6)臨床資料不全者。重度腦外傷繼發(fā)性癲癇患者腦外傷后24 h內(nèi)出現(xiàn)癲癇11例，2周內(nèi)發(fā)作35例，1個月內(nèi)發(fā)作15例。選取同期本院體檢健康者70例為對照組，其中男40例，女30例；年齡22～78歲，平均(39.14±16.12)歲。重度腦外傷患者與對照組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究征得所有受試者和其家屬同意，并簽署知情同意書；本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、人白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號bsk11014、bs-0782R)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(武漢默沙克生物公司，批號69-86579)；miRNA提取試劑盒(日本Takara公司，批號RA207004)；RNA SYBR Green PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?，批號KL101-969)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司，批號Q6099)；Multiskan FC型全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；5427R型艾本德臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；SmartSpec Plus型核酸純度分析儀(美國伯樂公司)；CFX96型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集和處理 腦外傷患者入院24 h內(nèi)、對照組入院體檢當(dāng)天抽取研究對象靜脈血4 mL，裝入EP管中，室溫靜置35 min后，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清液，分裝，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測外周血miR-146a的表達(dá) 將樣品和試劑在常溫下復(fù)融，打開超凈工作臺滅菌30 min。在無菌超凈工作臺和冰盒上提取總RNA，用核酸純度分析儀測量A260 nm/A280 nm是否在1.8～2.0，并將提取的RNA分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆?。依?jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄步驟，按照逆轉(zhuǎn)錄參數(shù)合成cDNA。采用qRT-PCR測定miR-146a水平，在避光環(huán)境下嚴(yán)格按照熒光定量PCR試劑盒操作步驟，利用qRT-PCR儀按照設(shè)定程序進(jìn)行操作。程序設(shè)定參數(shù)為94 ℃預(yù)熱1 min，94 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 20 s，共35個循環(huán)?？偡磻?yīng)體系(20.0 μL)：SYBR Green mix 10.0 μL，上下游引物各2.0 μL，cDNA模板3.0 μL，ddH2O 3.0 μL。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，每例樣本重復(fù)操作3次，記錄Ct值，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt算法計算miR-146a相對表達(dá)量。引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3TNF-α、IL-6、IL-1β水平檢測 采用TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒檢測所有受試者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

2 結(jié) 果

2.13組受試者血清miR-146a水平比較 與對照組相比，重度腦外傷繼發(fā)性癲癇組、單一重度腦外傷組患者血清miR-146a水平較高(P<0.05)，與單一重度腦外傷組相比，重度腦外傷繼發(fā)性癲癇組患者血清miR-146a水平較高(P<0.05)。見表2。

表2 3組受試者血清miR-146a水平比較

2.23組受試者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 與對照組相比，重度腦外傷繼發(fā)性癲癇組、單一重度腦外傷組患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平較高(P<0.05)，與單一重度腦外傷組相比，重度腦外傷繼發(fā)性癲癇組患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平較高(P<0.05)。見表3。

表3 3組受試者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

2.3重度腦外傷繼發(fā)性癲癇患者血清miR-146a水平與血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平相關(guān)性分析 重度腦外傷繼發(fā)性癲癇患者血清miR-146a與TNF-α、IL-6、IL-1β水平呈正相關(guān)(r=0.580、0.505、0.474，P<0.05)。

2.4影響重度腦外傷繼發(fā)性癲癇多因素分析 以是否發(fā)生繼發(fā)性癲癇為因變量，以血清miR-146a、TNF-α、IL-6、IL-1β水平為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示血清miR-146a、TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高是重度腦外傷繼發(fā)性癲癇的危險因素(P<0.05)。見表4、表5。

表4 變量賦值

表5 影響重度腦外傷繼發(fā)性癲癇的多因素分析

3 討 論

繼發(fā)性癲癇是重度腦外傷后常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，進(jìn)一步加重了腦組織病理和神經(jīng)損傷[8]。繼發(fā)性癲癇使重度腦外傷致殘率、病死率不斷上升。有研究顯示，癲癇發(fā)病過程與炎癥因子和神經(jīng)系統(tǒng)炎癥相關(guān)[9]。神經(jīng)系統(tǒng)炎癥在癲癇發(fā)作過程中發(fā)揮著重要作用，這與腦損傷有重要關(guān)系[10]。TNF-α、IL-6、IL-1β是與神經(jīng)系統(tǒng)炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，在癲癇發(fā)作中發(fā)揮重要作用[11]。惲鴻博等[9]研究發(fā)現(xiàn)腦梗死繼發(fā)癲癇組和單一腦梗死組患者血清TNF-α、IL-1β水平明顯高于健康體檢組，腦梗死繼發(fā)癲癇組患者血清TNF-α、IL-1β水平明顯高于單一腦梗死組患者。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，重度腦外傷繼發(fā)性癲癇組、單一重度腦外傷組患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著較高，與單一重度腦外傷組相比，重度腦外傷繼發(fā)性癲癇組患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯較高，提示炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β在繼發(fā)性癲癇發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA在癲癇疾病發(fā)病過程中具有重要作用[4]。miR-146a是第一個被發(fā)現(xiàn)的具有免疫調(diào)節(jié)作用的微小RNA，在炎性反應(yīng)、細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[12]。LV等[13]發(fā)現(xiàn)miR-146a能影響巨核細(xì)胞增殖、分化，可能通過TLR4信號通路調(diào)控血小板免疫炎性反應(yīng)。DENG等[14]也發(fā)現(xiàn)miR-146a在人星形膠質(zhì)細(xì)胞中水平呈上升趨勢，且miR-146a可通過抑制TLR4信號通路調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子釋放。ORGANISTA-JUREZ等[15]發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇患者大腦新皮層miR-146a水平顯著上調(diào)，且與癲癇發(fā)作頻率相關(guān)。ANSARI等[16]報告阿爾茨海默病患者的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-146a水平顯著增加，miR-146a可能參與了大腦發(fā)育和神經(jīng)變性。本研究發(fā)現(xiàn)，重度腦外傷繼發(fā)性癲癇組、單一重度腦外傷組患者血清miR-146a水平皆顯著高于對照組(P<0.05)，重度腦外傷繼發(fā)性癲癇組血清miR-146a水平顯著高于單一重度腦外傷組(P<0.05)，提示miR-146a可能參與重度腦外傷繼發(fā)性癲癇的發(fā)生。ZHANG等[17]研究發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠腦組織中miRNA-146a水平顯著高于對照組，且與促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平變化相同，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-146a與IL-1β、IL-6和TNF-α呈正相關(guān)(P<0.05)，提示重度腦外傷患者miR-146a可能通過影響IL-1β、IL-6和TNF-α進(jìn)一步影響繼發(fā)性癲癇發(fā)作。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-146a、TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高是影響繼發(fā)性癲癇的危險因素，提示檢測血清miR-146a水平可為臨床診斷繼發(fā)性癲癇的發(fā)生提供參考依據(jù)。

綜上所述，重度腦外傷繼發(fā)性癲癇患者血清miR-146a水平上調(diào)，miR-146a是影響繼發(fā)性癲癇的危險因素，監(jiān)測重度腦外傷患者血清miR-146a有助于診斷繼發(fā)性癲癇的發(fā)生。本研究由于樣本數(shù)量有限，研究結(jié)果具有一定的局限性。本課題組將進(jìn)一步增加樣本量探討重度腦外傷患者血清miR-146a與繼發(fā)性癲癇的關(guān)系。